Saggio di efferocitosi cellulare fissa: un metodo per studiare l'assorbimento efferocitico delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi utilizzando la microscopia a fluorescenza

Abstract

Fonte: Taruc, K., et al. Quantificazione dell'efferocitosi mediante microscopia a fluorescenza a cellula singola. J. Vis. Exp. (2018).

In questo video, dimostriamo il test di efferocitosi per studiare la clearance delle cellule apoptotiche utilizzando la microscopia confocale. L'efferocitosi è un processo in più fasi in cui le cellule apoptotiche vengono inghiottite dai fagociti e degradate all'interno di vescicole chiamate efferosomi. Questo protocollo fornisce un metodo per visualizzare porzioni internalizzate e non internalizzate di singole cellule apoptotiche e quantificare l'efferocitosi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Coltura e preparazione della linea cellulare di monociti THP-1

1. Coltura di monociti THP-1 in sospensione in fiasche T25 a 37 °C + 5% CO₂. Le cellule devono essere coltivate in 5 ml di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% di siero fetale bovino (FBS).
2. Ogni giorno, sospendere le cellule in modo uniforme in tutto il terreno di crescita agitando delicatamente il pallone, quindi contare immediatamente le cellule con un emocitometro. Le cellule devono essere fatte passare una volta che la densità cellulare raggiunge 1 x 10⁶ cellule/mL:
   1. Preriscaldare RPMI 1640 + 10% FBS in un bagno d'acqua a 37 °C.
   2. Trasferire 2 x 10⁵ celle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL o in una provetta conica da 15 mL e le celle a pellet centrifugando a 500 x g a temperatura ambiente per 5 minuti.
   3. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere il pellet in 1 mL (provetta da microcentrifuga da 1,5 mL) o 5 mL (provetta conica da 15 mL) di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   4. Centrifugare la provetta a 500 x g a temperatura ambiente per 5 minuti. Rimuovere il PBS senza disturbare il pellet della cella.
   5. Risospendere il pellet in 1 mL di RPMI 1640 fresco + 10% FBS.
   6. In un nuovo pallone T25 versare 4 mL di terreno riscaldato e a questo aggiungere le cellule risospese da 1.2.5. Coltura in un incubatore a 37 °C + 5% di CO₂ fino a quando le cellule non richiedono il passaggio (in genere 3 giorni) o fino a quando le cellule non sono necessarie per un esperimento.
3. Per un esperimento con macrofagi derivati da THP-1, rimuovere il numero richiesto di cellule dal pallone e dalla piastra prima del passaggio:
   1. Posizionare il numero richiesto di vetrini coprioggetti circolari da 18 mm (spessore #1,5) nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti, in genere 1 vetrino coprioggetti per condizione e/o punto temporale. In ogni pozzetto aliquotare 5 x 10⁴ monociti THP-1. Il numero di celle aggiunte a ciascun pozzetto può essere modificato se necessario.
   2. Portare il volume totale di ciascun pozzetto contenente cellule a 1 mL utilizzando RPMI + 10% FBS riscaldato a 37 °C.
   3. Aggiungere 100 nM di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) a ciascun pozzetto e coltivare per 3 giorni per indurre la differenziazione dei monociti THP-1 in cellule simili ai macrofagi.

2. Coltura e preparazione della linea cellulare di macrofagi J774.2

1. Coltura di cellule J774.2 in matracci T25 a 37 °C + 5% CO₂. Le cellule devono essere coltivate in 5 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS e fatte passare una volta che la coltura raggiunge l'80-90% di confluenza. Alle celle di passaggio:
   1. Rimuovere tutto il terreno dal pallone e far lievitare una volta con 5 mL di PBS.
   2. Rimuovere il PBS dal pallone e sostituirlo con 5 ml di DMEM fresco + 10% FBS.
   3. Utilizzando un raschietto per cellule, raschiare il fondo del pallone per sospendere le cellule nel terreno. Pipettare energicamente le cellule più volte per rompere eventuali aggregati cellulari.
   4. Diluire le cellule 1:5 rimuovendo 4 mL della sospensione cellulare dal pallone e sostituendola con 4 mL di terreno fresco. La sospensione cellulare rimanente può essere scartata, utilizzata per avviare una nuova coltura cellulare in un nuovo pallone T25 o utilizzata per un esperimento.
2. Per l'impostazione di un test di efferocitosi utilizzando le cellule J774.2:
   1. Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, sospendere le cellule J774.2 in 5 ml di terreno fresco, come per i passaggi 1.1.1-1.1.3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare il volume necessario di cellule a una concentrazione di 5 x 10⁴ cellule/mL.
   2. Posizionare il numero necessario di vetrini coprioggetti circolari da 18 mm (spessore #1,5) nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. In ogni pozzetto aliquotare 1 mL della sospensione cellulare 5 x 10^{a 4} cellule/mL.
   3. Coltura notturna per consentire alle cellule di aderire al vetrino coprioggetti e riprendersi dal passaggio.

3. Cultura dei macrofagi M2 umani primari

1. Raccogliere 10 ml di sangue umano eparinizzato per ogni piastra a 12 pozzetti di macrofagi M2 necessaria.
2. In una provetta da centrifuga da 15 mL, sovrapporre 5 mL di sangue umano sopra 5 mL di terreno di separazione linfolita-policellulare preriscaldato. Preparare più provette se si elaborano >5 ml di sangue piuttosto che utilizzare provette di volume maggiore.
3. Centrifugare a 300 x g per 35 min, utilizzando un'accelerazione media e senza interruzioni.
4. Rimuovere con cautela la banda superiore ricca di cellule mononucleari utilizzando un pipettatore di plastica e trasferirla in una provetta da centrifuga da 50 mL. Se sono state preparate più provette nella fase 3.2, le bande possono essere raggruppate in un'unica provetta da 50 mL. Porta il volume della provetta fino a 50 mL con PBS.
5. Centrifugare a 300 x g per 8 min e rimuovere il surnatante. Durante questa fase, posizionare i vetrini coprioggetti circolari autoclavati di 18 mm di diametro (spessore #1,5) in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
6. Risospendere il pellet cellulare in 300 μL di RPMI 1640 senza siero per il numero di pozzetti desiderato; Ad esempio, se sono stati processati 10 mL di sangue per preparare una piastra completa a 12 pozzetti, sospendere il pellet cellulare in 3,6 mL di terreno.
7. Aggiungere 300 μl della sospensione cellulare a ciascun pozzetto contenente vetrino nella piastra a 12 pozzetti. Incubare per 1 ora a 37 °C + 5% CO₂.
8. Lavare delicatamente il vetrino coprioggetti 3 volte con 1 mL di PBS riscaldato per rimuovere eventuali cellule non aderenti.
9. Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL di M-CSF umano ricombinante + antibiotico/antimicotico per colture cellulari. Incubare a 37 °C + 5% CO₂ per 5 giorni.
10. Sostituire i terreni con RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL di M-CSF umano ricombinante + 10 ng/mL di IL-4 umana ricombinante + antibiotico/antimicotico per colture cellulari. Incubare a 37 °C + 5% CO₂ per 2 giorni per completare la polarizzazione M2.
11. I macrofagi polarizzati devono essere utilizzati entro i prossimi 3 giorni.

4. Preparazione delle cellule Jurkat apoptotiche

1. Coltura di cellule Jurkat in 5 mL di RPMI 1640 + 10% FBS a 37 °C + 5% CO₂. I jurkat sono una linea cellulare in sospensione e possono essere mantenuti passando 1:5 in terreni freschi e preriscaldati ogni 3-5 giorni.
2. Per preparare le cellule apoptotiche, lasciare che la coltura Jurkat cresca ad alta densità (4-5 giorni dopo il passaggio). Aliquotare 1,5 mL in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e le celle a pellet mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min.
3. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno RPMI 1640 privo di siero contenente 1 μM di staurosporina.
4. Incubare 16 ore a 37 °C + 5% CO₂ per rendere le cellule apoptotiche.
5. Se lo si desidera, confermare l'induzione dell'apoptosi colorando con l'annessina V:
   1. Aliquotare 100 μL di coltura cellulare Jurkat trattata con staurosporina in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 500 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet della cella in 100 μL di terreno RPMI 1640 privo di siero.
   2. Aggiungere 1 μl di annessina V coniugata con isotiocianato di fluoresceina (FITC) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
   3. Aggiungere 900 μl di PBS e trasferire l'intero volume in un singolo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenente un vetrino coprioggetto circolare da 18 mm (spessore #1,5). Centrifugare in una centrifuga dotata di un adattatore per piastre a 200 x g per 1 minuto per forzare le celle ad aderire al vetrino coprioggetti. In alternativa, le cellule possono essere inserite in un vetrino a camera per l'imaging.
   4. Immagine con un microscopio a fluorescenza.

5. Quantificazione dell'assorbimento e della dinamica efferocitica utilizzando un test di efferocitosi cellulare fissa e colorazione inside-out

1. Preparare i macrofagi umani THP-1, J774.2 o M2 come descritto rispettivamente nelle sezioni 1-3.
2. La sera prima dell'inizio dell'esperimento, preparare le cellule Jurkat apoptotiche come descritto nella Sezione 4.
3. Immediatamente prima dell'esperimento, contare le cellule apoptotiche utilizzando un emocitometro. Trasferire un numero sufficiente di cellule apoptotiche in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL - di solito aggiungiamo 5 x 10⁵ cellule/pozzetto, fornendo un rapporto target:efferocita di 10:1.
4. Pellet Celle Jurkat mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min e risospensione in 500 μL di PBS.
5. Durante la centrifugazione, aliquotare 10 μL di DMSO in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Sciogliere nel DMSO una quantità minima di N-idrossisuccinimidobiotina (NHS-Biotina). 5-10 cristalli (~0,005 mg) sono sufficienti.
6. Trasferire la sospensione di cellule apoptotiche/PBS da 500 μl nella provetta contenente biotina DMSO/NHS. Quindi diluire un colorante per il tracciamento delle cellule alla concentrazione raccomandata dal produttore nella sospensione cellulare apoptotica. Assicurati di selezionare un colorante per il tracciamento delle cellule che non si sovrapponga spettralmente alla FITC-streptavidina (ad es. colorante per il tracciamento delle cellule rosse o rosso lontano).
7. Incubare la sospensione per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Aggiungere un volume uguale di RPMI 1640 + 10% FBS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente al buio per estinguere eventuali coloranti non reagiti.
8. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 500 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule apoptotiche colorate in 100 μL di RPMI 1640 + 10% FBS per pozzetto di macrofagi.
9. Aggiungere 100 μl di sospensione cellulare apoptotica colorata goccia a goccia a ciascun pozzetto dei macrofagi. Centrifugare 200 x g per 1 minuto in una centrifuga dotata di un adattatore per piastra per forzare il contatto tra macrofagi e cellule apoptotiche.
10. Incubare la piastra per il periodo di tempo desiderato a 37 °C + 5% CO₂ in un incubatore per colture tissutali. Per i macrofagi, il materiale efferocitoso è solitamente rilevabile per la prima volta dopo 20-30 minuti e viene completato dopo 120-180 minuti.
11. Al momento o ai punti temporali desiderati, rimuovere le cellule dall'incubatore. Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS a temperatura ambiente per arrestare l'efferocitosi e rimuovere le cellule apoptotiche non efferocitate.
12. Aggiungere streptavidina coniugata con FITC a una diluizione di 1:1.000 in ciascun pozzetto e incubare per 20 minuti al buio. Questo etichetterà la biotina esposta su qualsiasi materiale cellulare apoptotico non efferocitato.
    nota: Se lo si desidera, i nuclei cellulari possono essere colorati durante questa fase con l'aggiunta di diluizione 1:20.000 di Hoechst 33342 o 4',6-Diamidino-2-Fenilidolo, Dicloridrato (DAPI).
13. Lavare le celle 3 volte con 1 mL di PBS, agitando delicatamente o facendo oscillare i campioni per 5 minuti per risciacquo. Fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare le celle una volta con PBS per rimuovere il PFA in eccesso.
14. Montare i vetrini coprioggetti su un vetrino per l'imaging e trasferirli su un microscopio a fluorescenza. Cattura z-stack di un numero sufficiente di celle per una quantificazione accurata, in genere 10-30 celle per condizione. Il materiale cellulare apoptotico non internalizzato sarà evidente nell'immagine risultante come materiale marcato con colorante a tracciamento cellulare avvolto da colorazione con fitc-streptavidina, mentre il materiale efferocitoso forma punti di colorante a tracciamento cellulare discreti privi di qualsiasi colorazione con streptavidina.
15. Quantificare l'efferocitosi nelle immagini risultanti attraverso una varietà di misure:
    1. Calcola l'indice efferocitico determinando il numero medio di efferosomi discreti (colorante di tracciamento cellulare+/streptavidina-puncta) per macrofago. Quantificare solo i macrofagi legati a una cellula apoptotica o contenenti ≥1 efferosomi visibili. Registra i macrofagi legati a una cellula apoptotica, ma privi di efferosomi discreti, come aventi un indice efferocitico di 0.
    2. Calcola l'efficienza efferocitica misurando la frazione di macrofagi che contengono ≥1 efferosoma.
    3. Calcola il tasso di efferocitosi visualizzando le cellule fissate e colorate in più punti temporali. Immagine solo dei macrofagi legati a cellule apoptotiche, o contenenti efferosomi visibili, con z-stack catturati di ciascuna cellula. Una volta effettuata l'immagine, determinare il tasso di efferocitosi:
       1. Utilizzando la colorazione con streptavidina come guida e lo strumento di selezione a mano libera o poligono in FIJI/ImageJ (o altro pacchetto software di analisi delle immagini), cerchiare tutto il colorante di tracciamento cellulare+/streptavidina- (ad es. internalizzato) in un unico piano dello z-stack. Misurare l'intensità integrata del colorante di tracciamento cellulare in questa regione. Le misure individuali per ciascun efferosoma (ad es. diametro, posizionamento rispetto al bordo cellulare o al nucleo, ecc.) possono essere facilmente acquisite contemporaneamente a queste misurazioni, aumentando notevolmente i dati raccolti durante l'analisi.
       2. Sulla stessa sezione z, utilizzando la colorazione con streptavidina come guida e lo strumento di selezione a mano libera o poligono, cerchiare tutto il colorante di tracciamento cellulare+/streptavidina+ (ad es. non internalizzato) in un singolo piano dello z-stack. Includere solo la colorazione da cellule apoptotiche a contatto con il fagocita . Misura l'intensità integrata di questa regione.
       3. Ripetere i passaggi da 4.2.3.1 a 4.2.3.2 per le sezioni z rimanenti dell'immagine. Somma l'intensità integrata dei materiali efferocitati (Σ_eff) e non efferocitati (Σ_ne). La frazione della cellula apoptotica che è stata efferocitata può essere calcolata per la cellula come:
          
       4. Quantificare la frazione efferocitosa per tutte le cellule in tutti i punti temporali. Si noti che l'intensità fluorescente delle cellule/efferosomi apoptotici può variare tra le immagini a causa delle variazioni nell'assorbimento dei coloranti di tracciamento cellulare da parte delle singole cellule apoptotiche e a causa di cambiamenti nei parametri di acquisizione dell'immagine come il tempo di esposizione. Pertanto, confrontare solo valori normalizzati come la frazione efferocitata o valori indipendenti dall'intensità come l'indice efferocitico e l'efficienza efferocitica, tra immagini, tra condizioni sperimentali e tra esperimenti ripetuti.
    4. Per garantire che il set di dati risultante rifletta accuratamente la variazione dell'efferocitosi tra le cellule, condurre queste analisi sul numero massimo di cellule possibile in ogni esperimento><. nota: L'efficienza efferocitica e l'indice efferocitico possono essere calcolati rapidamente (pochi secondi/cellula) e in genere miriamo ad analizzare almeno 100 cellule per esperimento, ripetendo ogni esperimento almeno 3 volte. Il calcolo della frazione di materiale efferocitoso e le misure specifiche dell'efferosoma sono più laboriose e richiedono in genere 2-3 minuti/cellula per un analista esperto. Per questi calcoli, quantifichiamo un minimo di 15 celle per condizione, per esperimento.
    5. Registrare i dati sull'indice efferocitico, sulla frazione efferocitata e sui singoli efferosomi su base per cellula.
       nota: Ciò consente l'analisi dei dati utilizzando approcci a cella singola, consentendo così di quantificare le variazioni tra le celle. Le analisi a livello di popolazione possono ancora essere condotte su questi set di dati facendo la media dei dati di singole cellule acquisiti in singoli esperimenti. Le misurazioni specifiche degli efferosomi possono essere analizzate a livello di popolazione, a livello di singola cellula e come ensemble (ad esempio come popolazioni di efferosomi indipendenti dalle cellule che li contengono).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supporti RPMI 1640	bisonte europeo	3500-000-EL
Supporti DMEM	bisonte europeo	319-005-CL
Siero fetale bovino (FBS)	bisonte europeo	080-150
Pbs	bisonte europeo	311-010-CL
Vetrini coprioggetti circolari in vetro da 18 mm spessore #1,5	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 72290-08	Le dimensioni e la forma del vetrino coprioggetti non sono critiche, ma 18 mm si inseriscono nei pozzetti di una piastra standard a 12 pozzetti che semplifica la coltura cellulare
Staurosporina	Cayman Chimica	Codice 81590	Sciogliere in DMSO a 1 mM (1.000x soluzione madre)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	Codice: R37174
EZ-Link NHS-Biotina	ThermoFisher	20217	Conservare in un essiccatore. Non preparare una soluzione stock.
Dmso	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	Codice C34572
CellTrace Arancione	ThermoFisher	Codice C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	Codice 62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Terreno di sepredazione linfoliti-policellule	Laboratori Cedarlane	CL5071
M-CSF umano ricombinante	Peprotech	200-04
IL-4 umana ricombinante	Peprotech	300-25
Linea cellulare di macrofagi J774.2	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
Linea cellulare di monociti umani THP-1	ATCC	TIB-202
Linea di cellule T Jurkat	ATCC	TIB-152