Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei media
- Aggiungere tutti i componenti, come descritto nella Tabella 1, per ottenere il terreno di base per la raccolta degli ovociti e il terreno di maturazione degli ovociti. Per il mezzo di raccolta di base, impostare il pH su 7,4. Sia per il terreno di raccolta che per quello di maturazione, aggiungere 3 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) e 1 μM di cilostamide il giorno dell'uso.
2. Preparazione della codifica dell'mRNA per Ypet-3' UTR e mCherry
- Ottenere le sequenze 3' UTR degli mRNA di interesse.
nota: Per questo studio, le sequenze sono state precedentemente ottenute dal cDNA degli ovociti di topo.
- Progettare primer per amplificare le UTR 3' target dal cDNA dell'ovocita e porzioni del vettore pcDNA 3.1 contenenti una sequenza codificante Ypet, un tag epitopo V5 e un promotore T7.
- Amplifica utilizzando un kit di DNA polimerasi ad alta fedeltà. Eseguire i prodotti della reazione a catena della polimerasi (PCR) su un gel per verificare se i frammenti hanno le dimensioni corrette, ritagliare le bande ed estrarre il DNA dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
- Fondere i frammenti PCR in un vettore utilizzando un kit di clonazione PCR.
nota: I frammenti di PCR sono stati incubati su ghiaccio per 4 ore per facilitare un processo di ricombinazione più efficiente. Ciò è contrario alle istruzioni del produttore, che raccomandano un tempo di incubazione di soli 45 minuti.
- Trasfettare i frammenti della PCR in batteri 5-α Escherichia coli competenti.
- Aggiungere la miscela e il plasmide ai batteri e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
- Scaldare la miscela e il plasmide ponendo la miscela a bagnomaria a 42 °C per 45 s e raffreddare immediatamente con ghiaccio per 3 minuti.
- Aggiungere 500 μl di brodo Super Optimal con terreno di repressione dei cataboliti (SOC) e incubare per 1 ora a 37 °C.
- Centrifugare a 7000 × g per 2 minuti e rimuovere la maggior parte del surnatante. Risospendere e impiattare su una piastra di agar Luria Broth (LB) con l'antibiotico di selezione appropriato.
nota: In questo studio è stata utilizzata la carbenicillina.
- Incubare per una notte a 37 °C. Isolare le colonie premendo leggermente la punta di una pipetta su una delle colonie e posizionandola in 3 mL di terreno LB con 100 μg/mL di carbenicillina. Incubare per 12-24 ore a 37 °C.
- Estrarre il DNA dei plasmidi utilizzando il kit di isolamento del DNA plasmidico secondo le istruzioni del produttore e confermare le sequenze tramite sequenziamento del DNA.
- Per Ypet/3' UTR:
- Produrre un modello di PCR lineare per la trascrizione in vitro. Utilizzare un primer diretto a monte della sequenza Ypet e un primer inverso con 20 residui di timina aggiuntivi. Vedere la Tabella 2 per la sequenza di Ypet/IL-7 3' UTR e le sequenze dei primer diretti e inversi.
nota: Questi residui aggiuntivi di timina aggiungeranno oligo(A) all'mRNA lineare dopo la trascrizione in vitro.
- Trascrivere in vitro il prodotto PCR utilizzando un kit di trascrizione T7 secondo le istruzioni del produttore.
- Purificare l'RNA complementare (cRNA) risultante utilizzando un kit di pulizia della trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
- Eluire il cRNA purificato in acqua priva di RNAsi, misurare la concentrazione e valutarne l'integrità mediante elettroforesi dell'agarosio. Conservare a −80 °C.
- Per mCherry:
- Produrre un modello di PCR lineare per la trascrizione in vitro utilizzando un enzima di restrizione ad alta fedeltà; utilizzare l'enzima di restrizione mfEI-HF se si replica questo esempio. Digerire in un tampone di digestione per una notte a 37 °C.
- Eseguire un gel per purificare il campione ed estrarre il DNA lineare utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
- Trascrivere in vitro il prodotto PCR utilizzando un kit di trascrizione T7 secondo le istruzioni del produttore.
- Poliadenilato il cRNA (150-200 nucleotidi) utilizzando un kit di coda in poli(A) secondo le istruzioni del produttore.
- Purificare il cRNA risultante utilizzando un kit di pulizia della trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
- Eluire il cRNA purificato in acqua priva di RNAsi, misurare le concentrazioni di mRNA e valutare l'integrità del messaggio mediante elettroforesi su gel. Conservare a −80 °C.
3. Procedura sperimentale
NOTA: Una panoramica schematica della microiniezione di ovociti e della successiva microscopia time-lapse è fornita nella Figura 1.
- Giorno 1
- Iniettare intraperitonealmente topi di 21 giorni con 5 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida per promuovere la crescita dei follicoli allo stadio antrale.
- Giorno 3
- Raccolta ovociti
- Aprire con cautela i follicoli antrali praticando un piccolo taglio nella parete del follicolo con un ago da 26 G. Isolare gli ovociti (COC) chiusi in cumulo intatti con diversi strati di cellule del cumulo utilizzando una pipetta di vetro azionata a bocca.
- Utilizzare una pipetta più piccola (leggermente più grande del diametro dell'ovocita) e denudare meccanicamente i COC mediante pipettaggio ripetuto.
nota: In alternativa, eseguire la microiniezione su COC intatti.
- Utilizzando una pipetta più grande, aspirare gli ovociti denudati e metterli in una piastra di Petri con un mezzo di maturazione integrato con 1 μM di inibitore della fosfodiesterasi, cilostamide, per prevenire la ripresa della maturazione meiotica. Porre la capsula nell'incubatrice per 2 ore per consentire agli ovociti di riprendersi dallo stress indotto dall'isolamento degli ovociti dai follicoli.
- Microiniezione di ovociti
- Preparare gli aghi per iniezione inserendo un tubo capillare in vetro borosilicato lungo 10 cm in un estrattore meccanico. Per un'iniezione ottimale, piegare la punta dell'ago con un angolo di 45° utilizzando un filamento riscaldato.
- Preparare piatti di polistirene con 20 μl di goccioline di terreno basico per la raccolta degli ovociti e coprire le goccioline con olio minerale leggero.
- Preparare una miscela reporter aggiungendo 12,5 μg/μL di Ypet-3' UTR e 12,5 μg/μL di mCherry. Preparare un volume maggiore e creare aliquote per esperimenti futuri per garantire concentrazioni di reporter simili. Conservare queste aliquote a -80 °C. Dopo lo scongelamento, centrifugare prima l'aliquota per 2 minuti a 20.000 x g e trasferirla in una nuova provetta da microcentrifuga.
nota: Questa centrifugazione eviterà che l'ago di iniezione venga intasato da potenziali aggregati nella miscela reporter.
- Caricare l'ago per iniezione per capillarità con circa 0,5 μL di miscela reporter.
- Posizionare la pipetta di tenuta e l'ago per iniezione caricato nei supporti e posizionarli nella gocciolina del terreno di raccolta degli ovociti. Aspirare una parte del terreno nella pipetta di contenimento.
- Aprire l'ago per iniezione picchiettandolo delicatamente contro la pipetta di contenimento.
- Mettere gli ovociti in una gocciolina di terreno di raccolta basico e iniettare 5-10 pL della miscela reporter.
- Incubare gli ovociti nel terreno di maturazione con 1 μM di cilostamide per 16 ore per consentire al segnale mCherry di stabilizzarsi.
- Preparare una capsula di Petri che verrà utilizzata per la microscopia time-lapse con almeno due goccioline da 20 μL di terreno di maturazione per ogni reporter iniettato: una goccia con 1 μM di cilostamide per gli ovociti arrestati con profase I di controllo e una gocciolina senza cilostamide per gli ovociti in maturazione. Coprire le goccioline con olio minerale leggero e metterle nell'incubatrice.
- Microscopia time-lapse
- Dopo la pre-incubazione, rimuovere gli ovociti iniettati dall'incubatrice e lavarli quattro volte in terreno di maturazione senza cilostamide. Mantenere alcuni ovociti nel terreno di maturazione con 1 μM di cilostamide come gruppo di controllo degli ovociti arrestati con profase I.
- Trasferire gli ovociti iniettati nelle rispettive goccioline sul piatto del microscopio time-lapse precedentemente preparato. Raggruppare gli ovociti utilizzando una pipetta di vetro chiusa (una pipetta chiusa può essere preparata tenendo la punta in una fiamma per alcuni secondi).
nota: Il raggruppamento degli ovociti aiuta a prevenire il loro movimento durante la registrazione.
- Posizionare la capsula sotto il microscopio dotato di un sistema di illuminazione a diodi emettitori di luce e di un tavolino motorizzato dotato di una camera ambientale mantenuta a 37 °C e 5% di CO2. Per replicare questo studio, utilizzare i seguenti parametri: set di filtri: specchio dicroico YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canale YFP (Eccitazione (Ex): S500/20 × 49057; Emissione (EM): D535/30 m 47281), canale mCherry (Es: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Inserire le impostazioni appropriate per l'esperimento time-lapse (vedere la Tabella dei materiali per il software utilizzato in questo studio): Fare clic su App | Acquisizione multidimensionale. Selezionare la prima scheda Main e selezionare timelapse, posizioni di più stage e più lunghezze d'onda.
- Seleziona la scheda Salvataggio per inserire la posizione in cui deve essere salvato l'esperimento.
- Selezionare la scheda Timelapse per inserire il numero di punti temporali, la durata e l'intervallo di tempo.
nota: La durata dell'esperimento time-lapse dipende dalla specie animale studiata, poiché i tempi di maturazione meiotica dell'ovocita differiscono tra le specie. In questo esperimento con ovociti di topo, gli ovociti sono stati registrati ogni 15 minuti per 16 ore.
- Selezionare la scheda Fase. Attiva il campo chiaro e individua la posizione degli ovociti aprendo una nuova finestra selezionando Acquisisci | Acquisisci | Mostra dal vivo. Una volta individuati gli ovociti, torna alla finestra di acquisizione multidimensionale e premi + per impostare la posizione degli ovociti.
- Seleziona la scheda Lunghezze d'onda e imposta 3 diverse lunghezze d'onda per campo chiaro (esposizione 15 ms), YFP (esposizione 150 ms per Ypet/IL7 3' UTR) e mCherry (esposizione 75 ms per Ypet/IL7 3' UTR).
nota: Regolare l'esposizione per ciascun reporter Ypet/3' UTR in base al livello di accumulo del reporter e al volume iniettato. Assicurarsi che il segnale YFP cada al centro del campo di rilevamento all'inizio dell'esperimento per evitare sottostima o saturazione in caso di attivazione della traduzione. Per mCherry, regolare l'esposizione per ogni lotto di mCherry poiché il segnale dipende dal numero di nucleotidi adenina aggiunti durante la procedura di poliadenilazione. A causa della variazione dell'efficienza di poliadenilazione, utilizzare lo stesso lotto di mCherry in esperimenti diversi per un migliore confronto tra gli esperimenti.
- Avvia l'esperimento time-lapse facendo clic su Acquisisci. Vedere la Figura 1 per un esempio di registrazione time-lapse in un singolo ovocita.
- Analisi della traduzione UTR di Ypet-3'
- Per questa analisi (vedere la tabella dei materiali per il software utilizzato in questo studio), eseguire due misurazioni della regione per ciascun ovocita: l'ovocita stesso - fare clic sulla regione dell'ellisse e circondare l'ovocita - e una piccola regione vicino all'ovocita da utilizzare per la sottrazione dello sfondo - fare clic sulla regione rettangolare.
nota: Assicurarsi che gli ovociti non si spostino fuori dalla regione selezionata durante la registrazione time-lapse. Prestare particolare attenzione al posizionamento della misurazione della regione intorno all'estrusione del globulo polare, poiché ciò provoca il movimento nell'ovocita e può distorcere la registrazione.
- Esporta i dati di misurazione della regione in un foglio di calcolo facendo clic prima su Apri registro e poi su Dati di registro per esportare il software di analisi dei dati.
- Per ogni singolo ovocita e per tutti i punti temporali misurati, sottrarre la misurazione della regione di fondo dalla misurazione della regione dell'ovocita. Eseguire questa operazione separatamente per le lunghezze d'onda YFP e mCherry.
Tabella 1: Preparazione dei supporti. Elenco dei componenti che devono essere aggiunti per preparare il terreno di raccolta degli ovociti di base e il terreno di maturazione degli ovociti.
| Terreno di base per la raccolta di ovociti | |
| componente | Per 500 mL |
| HEPES modificato Minimo Essenziale Medio Eagle | 7,1 g |
| bicarbonato di sodio | 252 mg |
| Piruvato di sodio | 1,15 ml |
| Penicillina/Streptomicina 100x | 5 ml |
| Acqua distillata ultrapura (Invitrogen, 10977-015) | Fino a 500 mL |
| Terreno di maturazione | |
| componente | Per 500 mL |
| MEM alfa 1x | Fino a 500 mL |
| Piruvato di sodio | 1,15 ml |
| Penicillina/Streptomicina 100x | 5 ml |
Tabella 2: Esempio di sequenze reporter e primer Sequenza del reporter YFP/IL7 3'UTR e sequenze di primer diretti e inversi che sono stati utilizzati per produrre un modello PCR lineare per la trascrizione in vitro.
| sequenza |
| Ypet/Interleuchina-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCCACCGGTCCCATGGTGAGCAAAGGCGAGGAGGAGCGAGCTGTTCACC
GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGGGGGGGGGGGGGCGCCCCACCTACGGCAAGCTGCTGCTGCACCGGCAAGCTGGCTGCACCACCGGCAAGCTG
CCCGTGCCCTGGCCCCCACCCTGGTGACCACCCTGGGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCCGGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCA
TCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACGACACCCTGGAACCGGATGGAGGATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAG
TACAACTACAACAGCCACAACGTACATCACCGCCGACAAGCAGAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGGCACACACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCA
TCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTGTTCAAGGACCCCAACGAAGCGGGACCACATGCTGCTGCTGGTGCTGGTGTTCCTGCCGCCGGCATCACCGAGGGC
ATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCGGTCTCGATTCTACGCGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGGACATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTT
CATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAGAAGTTCCTGGATGCCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAGAAATCTAGTGAGGTATGAGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATA
CATATAAAGATATATCAACTATACAGATTTTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTCTAACACTAAAGTCTACAAAAAGCAAAAGCAAAAGCAAAAGCAAAAGCAAAGACTGTTTTTTTTTTT
AGCAAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAGTGACTGTCCTGTTTTAGACTGGAGATACTGGAGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGCAGCAG
CAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATATGAATGTATAACACATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCATATTTTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTATTCCAAAGATACTGA
ACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAATTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAGAATAATAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATGTATGTTTAATTTTGGCATTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCT
CTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTATTATATATATTATATAATTTTCATACTACCAATTGCGTGTGGATAGTCTCTTTTTATACCTAAATATGACCTTTATTAACACTGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAG
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TTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGCCAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTATGTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTTTGTAAGGT
CTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTATGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCATTCTCCTTGCTTTTTCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCT
GGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCACATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTCCCCCCAACCCCTATAATGCTCTACTCAGTGGTACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAGAGAAAC
ACCAATTGTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTTGCCCAGAAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTTTCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGT
GTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTAAGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTCTCTATACCTGCAAGGCTGGATGGATGGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATT
TTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT |
| Innesco in avanti | GAGAACCCACTGCTTAC |
| Innesco inverso | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATATTATCCTTTTTTTTTGCCAAAATC |
