Saggio di monitoraggio dell'acidificazione intestinale: una tecnica per studiare l'acidificazione del lume intestinale in Drosophila utilizzando il colorante blu di bromofenolo

In questo articolo

Abstract

Fonte: Abu, F., et al. Monitoraggio dell'acidificazione intestinale nell'intestino adulto di Drosophila. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra un test per monitorare l'acidificazione intestinale nelle mosche Drosophila. Dopo l'ingestione di cibo integrato con un colorante indicatore di pH, l'acidificazione del lume intestinale provoca un cambiamento nel colore del colorante. L'ispezione visiva del tratto digestivo delle mosche per esaminare il cambiamento di colore fornisce prove di acidificazione.

Protocollo

NOTA: La linea di laboratorio standard Oregon R è stata utilizzata come controllo WT. Tutte le mosche sono state allevate su terreno standard di farina di mais e melassa (contenente melassa, agar, lievito, farina di mais, tegosept, acido propionico e acqua) a temperatura ambiente con ritmo circadiano luce/buio di 12/12 ore.

1. Preparazione per il test

Raccogli le mosche femmine (0-2 giorni, non vergini) in anestesia di CO₂ e lasciale riprendersi con il cibo standard a base di farina di mais per almeno 3 giorni prima degli esperimenti.
Far morire di fame le mosche per ~24 ore a temperatura ambiente (~23 °C) in fiale contenenti un fazzoletto da laboratorio imbevuto di ~2 mL di acqua deionizzata.
Preparare il cibo per mosche con blu di bromofenolo (BPB) come segue:
1. Sciogliere il cibo per mosche in un forno a microonde e poi lasciarlo raffreddare fino a quando non sarà tiepido.
2. Aggiungere 1 ml di BPB al 4% a 1 ml di cibo tiepido e mescolare bene.
3. Usando una pipetta, aggiungere il cibo per mosche contenente BPB in un singolo punto (~200 μL) al centro di una capsula di Petri.

2. Saggio di monitoraggio dell'acidificazione intestinale

Trasferire le mosche affamate in una capsula di Petri contenente singoli punti (200 μL) di cibo per mosche integrato con il 2% di blu di bromofenolo (BPB). Lasciare che le mosche si nutrano per 4 ore a temperatura ambiente mentre sono esposte alla luce.
Dopo 4 ore, raccogliere le mosche e anestetizzarle sul ghiaccio; isolare chirurgicamente le loro viscere.
1. Eseguire l'intervento chirurgico in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con pinza sotto uno stereomicroscopio (vedere la Tabella dei materiali). Isolare l'intestino tenendo il torace con un paio di pinze e tirando verso il basso l'addome con un secondo paio fino a quando il CCR dell'intestino è visibile, facendo attenzione a garantire che l'intestino rimanga attaccato ad entrambe le estremità.
Determinare l'acidificazione dell'intestino esaminando il colore del CCR dell'intestino (Figura 1C; il giallo indica acidificato e il blu indica non acidificato).
Conta solo quelle mosche che mostrano una robusta colorazione BPB nelle loro viscere.
Calcola la percentuale utilizzando la seguente equazione:
Percentuale di mosche con intestino acidificato = numero di mosche acidificate × 100 / (numero di mosche acidificate + numero di mosche non acidificate)
nota: Una percentuale di 0 indica che nessuna mosca ha acidificato il proprio intestino, mentre una percentuale di 100 indica che tutte le mosche hanno acidificato il proprio intestino.

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Risultati

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Figura 1: Monitoraggio dell'acidificazione intestinale.(A) Disegno schematico dell'arena di alimentazione. Il punto blu rappresenta il cibo per mosche con blu bromofenolo (un colorante che indica il pH). Altre macchie rappresentano i moscerini della frutta. (B) Rappresentazione grafica della percentuale di moscerini che mostrano acidificazione intestinale alimentati ...