$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Reagenti e soluzioni
- Produrre 500 mL di tampone MS-EGTA per l'isolamento mitocondriale: 225 mM di mannitolo, 75 mM di saccarosio, 5 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanesolfonico (HEPES), 1 mM di glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N',N'-tetraacetico (EGTA), pH regolato a 7,4 con KOH. Sterilizzarlo con un filtro da 0,22 μm e conservarlo a 4 °C. Assicurarsi che il tampone MS-EGTA sia pre-raffreddato a 4 °C prima dell'uso.
- Preparare 100 mL di tampone KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA e pH regolato a 7,2 con KOH. Conservalo a temperatura ambiente.
- Preparare 1 mM di brodo di verde di calcio-5N in dimetilsolfossido (DMSO). Il brodo di verde calcio-5N può essere aliquotato e conservato a -20 °C.
- Preparare i substrati per l'assorbimento del Ca2+.
- Preparare 1 M di piruvato di sodio, pH 7,4. Conservarlo in aliquote a -20 °C.
- Preparare 500 mM di malato, pH 7,4. Conservarlo in aliquote a -20 °C.
2. Isolamento dei mitocondri cardiaci
- Eutanasia del topo secondo gli standard istituzionali.
nota: Per il nostro metodo di eutanasia istituzionalmente approvato, i topi sono stati anestetizzati mediante inalazione di isofluorano e sacrificati mediante lussazione cervicale.
- Raccogli il cuore aprendo la cavità toracica, tagliando lungo entrambi i lati delle costole, fiancheggiando il cuore, tagliando via il diaframma e asportando il tessuto cardiaco.
nota: In questo protocollo, l'isolamento mitocondriale viene eseguito da un intero cuore raccolto da un topo adulto (circa 120 mg), che dovrebbe essere sufficiente per 3-4 esperimenti. Per l'isolamento mitocondriale da altri tessuti ricchi di mitocondri come il fegato, è possibile utilizzare fino a 200 mg di tessuto seguendo il protocollo descritto.
- Sciacquare accuratamente il tessuto in 25 ml di soluzione salina ghiacciata con tampone con fosfato (PBS) assicurandosi che tutto il sangue venga espulso dai ventricoli.
nota: Il cuore sarà sufficientemente risciacquato quando il liquido spremuto dal cuore sarà limpido.
- Tritare il cuore in piccoli pezzi in 5 ml di 1x PBS ghiacciato usando un paio di forbici affilate.
- Eliminare il PBS e trasferire il tessuto cardiaco tritato in un omogeneizzatore Dounce in vetro-teflon da 7 ml pre-raffreddato con una distanza compresa tra 0,10 e 0,15 mm.
- Aggiungere 5 mL di tampone MS-EGTA ghiacciato e omogeneizzare il campione fino a quando i pezzi di tessuto non sono più visibili (circa 11 colpi).
nota: Non omogeneizzare eccessivamente il tessuto in quanto l'obiettivo è ottenere mitocondri integri e funzionali.
- Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare l'omogenato a 600 x g a 4 °C per 5 minuti fino a ottenere nuclei e celle integre.
- Trasferire il surnatante in una provetta fresca da 15 ml e centrifugarlo a 10.000 x g a 4 °C per 10 minuti per pellettare i mitocondri.
- Scartare il surnatante e mantenere il pellet mitocondriale sul ghiaccio.
- Lavare due volte il pellet mitocondriale utilizzando un tampone MS-EGTA ghiacciato. Per ogni lavaggio, risospendere il pellet mitocondriale in 5 mL di tampone MS-EGTA, centrifugarlo a 10.000 x g a 4 °C per 10 minuti ed eliminare il surnatante.
- Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere i mitocondri in 100 μL di tampone MS-EGTA ghiacciato. Mantieni i mitocondri sul ghiaccio.
nota: I mitocondri dovrebbero essere utilizzati per la sperimentazione entro 1 ora.
- Misurare la concentrazione di proteine mitocondriali utilizzando un test delle proteine di Bradford.
3. Misurazione basata su lettore di piastre dell'assorbimento mitocondriale di calcio
NOTA: Qui viene descritto il protocollo per analizzare l'assorbimento mitocondriale di Ca2+ utilizzando un lettore di piastre multimodale dotato di iniettori. È possibile utilizzare qualsiasi lettore di piastre in grado di leggere la fluorescenza del verde di calcio-5N (eccitazione/emissione di 506/532 nm) in modalità cinetica con iniettori di reagenti automatizzati per mantenere la reazione protetta dalla luce.
- Programmare il lettore di piastre per eseguire una lettura cinetica della fluorescenza del verde di calcio-5N con misurazioni effettuate ogni secondo per un tempo di analisi totale di 1.000 s. Inoltre, programmare gli iniettori di reagenti per erogare 5 μl di soluzione di CaCl2 ai punti temporali di 30 s, 150 s, 300 s, 480 s e 690 s.
nota: La tempistica delle iniezioni di CaCl2 è definita dall'utente e può essere regolata in base alle esigenze sperimentali.
- Adescare gli iniettori di reagenti con la soluzione di CaCl2 da utilizzare.
nota: La concentrazione della soluzione di CaCl2 è definita dall'utente e può essere regolata in cicli successivi per titolare la quantità di Ca2+ necessaria per innescare l'apertura dell'MPTP.
- Aggiungere 200 μg di mitocondri a un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere il volume appropriato di tampone KCl al pozzetto in modo tale che il volume totale dei mitocondri e del tampone KCl arrivi a 197 μL.
- Aggiungere 1 μL di piruvato 1 M e 1 μL di malato 500 mM alla miscela di mitocondri. Preparare delicatamente per mescolare e incubare i mitocondri con i substrati per 2 minuti a temperatura ambiente per consentire ai mitocondri di diventare energizzati.
- Aggiungere 1 μL di 1 mM di brodo di verde di calcio-5N. Miscelare delicatamente mediante pipettaggio.
nota: Proteggere la reazione dalla luce in seguito all'aggiunta del colorante verde calcio-5N.
- Avvia il protocollo cinetico pre-programmato e monitora la fluorescenza del verde calcio-5N.