1. Preparazione di grandi vescicole unilamellari (LUV)
- Preparare i LUV per il loro utilizzo come imitatori della membrana cellulare per il saggio di perdita di fluorescenza.
- Miscelare con una siringa di vetro Hamilton fosfatidilcolina (DOPC, 786,11 g/mol), sfingomielina (SM, 760,22 g/mol) e colesterolo (Chol, 386,65 g/mol) al rapporto molare 4:4:2. La soluzione lipidica è ottenuta da una soluzione madre di ciascun lipide solubilizzato in un solvente metanolo/cloroformio (3/1; volume/volume) a 25 mg/mL in un pallone di vetro a fondo tondo da 25 mL. Sulla base di 4 μmol di DOPC, 4 μmol di SM e 2 μmol di Chol, la soluzione lipidica si ottiene dalla soluzione madre mescolando rispettivamente 126 μl, 117 μl e 31 μl.
cautela: Il metanolo è un solvente tossico e infiammabile e il cloroformio è tossico e cancerogeno. Entrambi devono essere maneggiati con l'adeguata protezione sotto un cappuccio.
- Evaporare metanolo/cloroformio utilizzando un evaporatore rotante sotto vuoto per 45-60 minuti a 60 °C fino alla formazione di un film lipidico essiccato.
- Preparare due soluzioni tampone HEPES di serie. Preparare il tampone HEPES 1 mescolando 20 mM di HEPES (238,3 g/mol) e 75 mM di NaCl (58,44 g/mol) e regolare il pH a 7,4. Preparare il tampone HEPES 2 mescolando 20 mM di HEPES e 145 mM di NaCl e regolare il pH a 7,4. I tamponi HEPES possono essere conservati a 4 °C per 1 mese.
nota: Si consiglia di controllare l'osmolarità dei tamponi utilizzando un osmometro.
- Preparare la soluzione di idratazione lipidica sciogliendo la coppia colorante-quencher fluorescente impermeabile alla membrana, acido 8-amnonaftalene-1, 3, 6-trisolfonico, sale disodico a 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) e p-xilene-bispiridinio bromuro a 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) in soluzione tampone HEPES. Mescolando ANTS con DPX si ottiene una soluzione di colore giallo. Per ottenere le concentrazioni di 12,5 mM di ANTS e 45 mM di DPX, sciogliere 21,4 mg e 76 mg, rispettivamente in 4 mL di tampone HEPES 1,
nota: La soluzione di idratazione lipidica può essere conservata per 2 settimane a 4 °C avvolgendo il tubo con un foglio di alluminio.
- Ricostituire le vescicole multilamellari (MLV) risospendendo il film lipidico essiccato con 1 mL della soluzione di idratazione lipidica e agitando fino alla dissoluzione del film lipidico essiccato. Assicurarsi che la soluzione sia completamente solubilizzata poiché piccoli aggregati lipidici avranno un impatto negativo sui passaggi precedenti. Inoltre, controllare la parete del pallone di vetro a fondo tondo per assicurarsi che non vi siano residui di pellicola lipidica.
nota: La soluzione apparirà opalescente e di colore giallo chiaro dopo la solubilizzazione.
- Sottoporre le vescicole a cinque cicli di congelamento/disgelo per ottenere vescicole unilamellari. Eseguire ogni ciclo mettendo il pallone di vetro a fondo tondo per 30 s in azoto liquido per la fase di congelamento, quindi lasciandolo a bagnomaria per 2 minuti per la fase di scongelamento.
nota: La temperatura dell'acqua del bagno dovrebbe essere di 5-10°C superiore alla temperatura di fusione dei lipidi.
- Preparare l'estrusore lipidico inserendo due supporti filtranti preumidificati con tampone HEPES in ciascun pezzo di estrusore di politetrafluoroetilene (PTFE) posto nel contenitore metallico dell'estrusore.
- Posizionare una membrana in policarbonato umidificato HEPES (dimensione dei pori di 0,1 μm, diametro 25 mm) sulla parte superiore di un supporto filtrante.
- Assemblare i due contenitori metallici dell'estrusore e avvitarli.
- Posizionare l'estrusore assemblato nel supporto e introdurre una siringa da 1 ml nell'apposito foro all'estremità di ciascun pezzo di estrusore di politetrafluoroetilene. L'estrusione corrisponde al passaggio del liquido testato da una siringa all'altra attraverso la membrana in policarbonato.
- Testare l'estrusore con 1 mL di tampone HEPES caricato in una delle siringhe da 1 mL per assicurarsi che non vi siano perdite o problemi.
- Sostituire il tampone HEPES da 1 mL con il campione MLV.
- Eseguire l'estrusione facendo passare il campione MLV da una siringa all'altra attraverso la membrana in policarbonato almeno 21 volte per ottenere LUV uniformi della stessa dimensione.
nota: L'estrusione deve essere eseguita a una temperatura superiore alla temperatura di fusione della miscela lipidica.
2. Purificazione dei LUV
- Preparare una purificazione della colonna per rimuovere le ANTS non incapsulate e l'eccesso di DPX.
- Introdurre il gel di destrano reticolato (G-50) risospeso in terreno acquoso con lo 0,01% di NaN3 (65 g/mol) in una colonna per cromatografia liquida (Luer Lock, Non-jacketed, 1,0 cm x 20 cm, volume del letto 16 mL) fino a 1 cm sotto la parte superiore della parte incolore della colonna.
- Apri il rubinetto e lascia che il liquido scorra per depositare il gel di destrano reticolato.
- Lavare la colonna eluendo con 20 mL di tampone HEPES 2 ed eliminare il flusso di uscita della colonna.
- Chiudere il rubinetto una volta che il volume morto di solvente sopra la colonna è ridotto al minimo (<100 μL) ma sufficiente per evitare l'essiccazione del gel di destrano reticolato.
- Posizionare i LUV appena estrusi (gialli) sulla colonna e lasciarli entrare nel gel di destrano reticolato.
- Aggiungere continuamente il tampone HEPES 2 alla colonna per eseguire la purificazione LUV.
- Eluire circa 2 mL di tampone HEPES 2 (non dimenticare di riempire regolarmente la parte superiore della colonna per evitare di seccare il gel di destrano reticolato): la soluzione gialla libera di ANTS e DPX migra più lentamente dei liposomi.
- Iniziare a raccogliere i LUV purificati in provette (1,5 mL).
- Osserva le gocce di eluente dalla colonna e quando diventano opalescenti, contengono liposomi. Sostituire la provetta per recuperare la frazione contenente LUV.
- Eluire fino a quando le gocce non sono più opalescenti (~1 mL). Successivamente, eluire altri 0,5 mL in una frazione separata e quindi interrompere l'eluizione.
NOTA: Gli standard sono ora disponibili in un'ampia gamma di pesi molecolari, come kit o pesi molecolari individuali per calibrare il volume di eluizione dei LUV.
- Avvolgere i tubi con i LUV in un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del colorante a fluorescenza.
- Lavare la colonna con 20 mL di tampone HEPES 2.
- I LUV possono quindi essere conservati per una settimana a 4 °C.
NOTA: Poiché la stabilità dei LUV può dipendere dalla concentrazione e dalla composizione dei LUV, nonché dalla forza ionica, le dimensioni dei LUV devono essere controllate utilizzando uno strumento di diffusione dinamica della luce (DLS) (vedere la sezione 4. Caratterizzazione delle dimensioni e dell'omogeneità dei LUV) prima di ogni test.
3. Quantificare la concentrazione di LUV
- Stimare la concentrazione di LUV mediante un kit di quantificazione dei fosfolipidi, che consente di valutare la concentrazione di colina. Questo test può essere applicato quando i fosfolipidi con colina contenente testa polare sono sostanziali (>50% dei LUV).
- Preparare il reagente colorante sciogliendo 18 mg di substrato cromogeno in 3 mL di tampone fornito.
- Caricare una cuvetta di polistirolo, 10 x 10 x 45 mm, con 3 mL di reagente colorante.
- Utilizzare il reagente colorante puro come condizione di bianco (Bianco). Aggiungere 20 μL di campione LUV (Test) o 20 μL di soluzione standard con concentrazione nota di colina (Standard).
- Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 37 °C in tutte le condizioni (Bianco, Test e Standard).
- Misurare l'assorbanza (densità ottica, OD) del campione di prova e della soluzione standard con la soluzione bianca come controllo a 600 nm con uno spettrofotometro.
- Verificare i valori di OD che consentono di stimare la concentrazione lipidica dei LUV, C[LUV], in equivalente di colina rispetto allo standard di concentrazione noto.
- Eseguire il calcolo utilizzando la seguente equazione:
C[LUV] (mol / l) = (OD campione / OD standard) x C[Standard] (mol / l)
NOTA: Il kit di quantificazione dei fosfolipidi ha fornito una soluzione standard di cloruro di colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL corrispondente alla concentrazione molare di C[Standard] = 3,87 mmol/L. OD Sample e OD Standard sono le assorbanze misurate a 600 nm rispettivamente per le soluzioni LUV e Colina.
4. Caratterizzazione delle dimensioni e dell'omogeneità dei LUV
- Eseguire una misurazione utilizzando uno strumento DLS per determinare la dimensione LUV (in nm) e l'indice di polidispersione (PdI).
- Programmare la "procedura operativa standard" (SOP) appropriata indicando la viscosità del solvente/tampone e della cuvetta utilizzata.
- Porre 500 μl della soluzione LUV in una semi-micro cuvetta di polistirene.
- Inserire la semi-micro cuvetta in polistirolo in uno strumento DLS.
- A temperatura ambiente, misurare la distribuzione dimensionale in termini di dimensione media (media Z) della distribuzione delle particelle e di omogeneità (indice di polidispersione, PdI).
- Tutti i risultati sono ottenuti da due misurazioni indipendenti eseguite ciascuna in tre cicli ripetitivi.
NOTA: I valori standard per i LUV saranno una dimensione media di 137 ± 7 nm con un PdI di 0,149 ± 0,041.
5. Preparazione di soluzioni peptidiche
- Preparare una soluzione madre del peptide, che deve essere analizzata per il test di perdita.
- Sciogliere la polvere di peptidi (purezza >95%) in acqua pura (ad esempio, 1 mg di peptide in 500 μL di acqua pura).
nota: Si raccomanda di diluire i peptidi in acqua pura e di evitare la solubilizzazione del dimetilsolfossido (DMSO), che potrebbe indurre artefatti (ad esempio, permeabilizzazione della membrana).
- Agitare la soluzione peptidica per 5 s.
- Sonicare la soluzione peptidica in un bagno di sonicazione ad acqua per 5 minuti e poi centrifugare per 5 minuti a 12.225 x g. Raccogliere il surnatante per la determinazione della concentrazione.
- Misurare l'assorbanza a 280 nm di tre diluizioni peptidiche indipendenti e quindi calcolare la concentrazione del peptide utilizzando il coefficiente di estinzione molare ε (a seconda del contenuto di triptofano e tirosina nella sequenza peptidica) e la regola di Beer-Lambert.
nota: Se il peptide contiene triptofano e tirosina, il coefficiente di estinzione molare ε è calcolato sulla base del triptofano ε = 5.690 M-1 cm-1 e della tirosina ε = 1.280 M-1 cm-1. Se la sequenza peptidica non contiene triptofano o tirosina, è possibile eseguire altri test colorimetrici per misurare la concentrazione (ad esempio, BCA o Bradford).
- Diluire la soluzione peptidica in acqua pura fino a ottenere una soluzione finale di 100 μM e conservare a 4 °C.
nota: In acqua pura, non si verifica alcuna degradazione dei peptidi durante lo stoccaggio a 4 °C. Tuttavia, la concentrazione di peptidi deve essere misurata ogni 2 settimane per garantire che non si verifichi alcuna evaporazione dell'acqua.
6. Saggio di perdita di fluorescenza
- Il saggio di perdita di fluorescenza viene misurato su uno spettrofluorimetro a temperatura ambiente. La lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione è fissata rispettivamente a Ex = 360 nm ± 3 nm e Em = 530 nm ± 5 nm.
- Diluire i LUV in 1 mL di tampone HEPES 2 a una concentrazione finale di 100 μM in una cuvetta a fluorescenza al quarzo. Aggiungere un agitatore magnetico per omogeneizzare la soluzione durante l'esperimento.
- Misurare i LUV da soli durante i primi 100 s, tra t = 0 s e t = 99 s per accedere alla fluorescenza di fondo.
nota: I LUV da soli potrebbero anche essere misurati durante l'intero esperimento (15 minuti) per accedere alla fluorescenza di fondo e alle potenziali perdite.
- Successivamente, misurare la perdita come aumento dell'intensità della fluorescenza dopo l'aggiunta di aliquote di soluzione peptidica per i successivi 900 s (15 min). Questo protocollo viene eseguito per ogni concentrazione di peptide testata da 0,1 μM a 2,5 μM.
- Infine, la fluorescenza del 100% è stata ottenuta solubilizzando i LUV mediante l'aggiunta di 1 μL di Triton X-100 (0,1%, v/v), ottenendo la sonda completamente non spenta tra t = 1.000 s e t = 1.100 s.
7. Quantificazione della perdita
- Sopprimere i valori ottenuti dopo t = 1.090 s per mantenere lo stesso numero di punti per ogni condizione testata.
- Calcola la fluorescenza minima, Fmin, facendo la media di 50 punti tra t = 0 s e t = 49 s (solo LUV).
- Calcola la fluorescenza massima, Fmax, facendo la media di 50 punti tra t = 1.041 s e t = 1.090 s (LUV con Triton X-100).
- Calcola la percentuale di perdita (%Perdita) in ogni punto temporale (t = x), secondo la seguente equazione:
%Perdita(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
- Calcolare la media e la deviazione standard per i valori ottenuti con diversi preparati LUV (n ≥ 2) per la stessa condizione.
- Traccia la percentuale di perdita, %Leak(t=x), in funzione del tempo (s).
