1. Raccolta e lavorazione delle piante
- Raccolta ed elaborazione di campioni di piante
- Dopo aver raccolto i campioni di piante, congelare i campioni immergendo il materiale vegetale nell'azoto liquido con una pinza e conservarli a -80 °C. Se i campioni di piante raccolti sono troppo grandi per essere congelati, raffreddare rapidamente i campioni con ghiaccio secco e trasferirli in un congelatore a -80 °C il prima possibile. Il contenuto di macronutrienti del materiale vegetale può cambiare dopo che i tessuti sono stati separati dalla pianta, quindi è importante congelare i campioni di piante il prima possibile dopo la raccolta><.
ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare gravi congelamenti a contatto con la pelle. Assicurati di trasportare l'azoto liquido in contenitori approvati e di indossare DPI adeguati durante la sua manipolazione, inclusi crio-guanti, occhiali per gli occhi, visiera, grembiule e camice da laboratorio.
- Liofilizzare il materiale vegetale utilizzando un liofilizzatore per garantire che i tessuti siano metabolicamente inattivi durante la rimozione dell'acqua. Asciugare fino a quando la massa del campione non si stabilizza per assicurarsi che tutta l'acqua sia stata rimossa.
- Una volta che i campioni sono asciutti, macinarli in una polvere fine utilizzando un macinatore o un mulino. Conservare i campioni in una camera di essiccazione fino all'analisi.
2. Saggio delle proteine solubili
- Preparazione del campione
- Pesare campioni replicati di ciascun tessuto, di circa 20 mg ciascuno, in provette per microcentrifuga in polistirene da 1,5 ml e in provette per etichette. Questi campioni saranno successivamente indicati come campioni sconosciuti. Registrare la massa esatta di ciascun campione, poiché queste informazioni saranno necessarie per calcolare la % di proteine solubili in ciascun campione sconosciuto. Utilizzare provette per microcentrifuga con coperchi di bloccaggio, poiché i coperchi non bloccabili potrebbero aprirsi durante la successiva fase di riscaldamento, con conseguente perdita della soluzione campione.
- Solubilizzare e isolare le proteine del campione sconosciute
- Utilizzando un micropipettatore, aggiungere 500 μl di NaOH 0,1 M a ciascuna provetta. Chiudere bene i coperchi e sonicare per 30 minuti. Preriscaldare un bagno di acqua calda 90 °C.
ATTENZIONE: L'idrossido di sodio è una base forte e può causare ustioni a contatto con la pelle. Sebbene 0,1 M NaOH rappresenti una bassa concentrazione, indossare guanti protettivi per evitare irritazioni cutanee.
- Mettere le provette in una griglia nel bagno di acqua calda per 15 minuti.
- Centrifugare le provette a 15.000 x g per 10 minuti. Pipettare il liquido surnatante in nuove provette per microcentrifuga etichettate, utilizzando una nuova punta per pipetta per ogni campione. Aggiungere 300 μl di NaOH 0,1 M alla provetta contenente il pellet e centrifugare nuovamente a 15.000 x g per 10 minuti. Anche in questo caso, raccogliere il liquido surnatante e combinarlo con l'altro liquido surnatante dello stesso campione. Questo è un potenziale punto di arresto e, se necessario, i campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte.
- Precipitare le proteine vegetali
- Neutralizzare il pH della soluzione surnatante aggiungendo 11 μl di HCl 5,8 M. Confermare un pH di ~7 immergendo la cartina di tornasole in ciascuna soluzione campione.
ATTENZIONE: L'acido cloridrico è un acido fortemente corrosivo che può causare ustioni a contatto con la pelle (applicazione cutanea o inalazione). Si prega di indossare guanti per evitare irritazioni cutanee durante la manipolazione dell'HCl.
- Aggiungere 90 μl di acido tricloroacetico (TCA) al 100% in ciascuna provetta e incubare le provette con ghiaccio per 30 minuti. La precipitazione delle proteine trasformerà la soluzione da limpida a opaca. Se ciò non si verifica dopo 30 minuti, conservare in frigorifero i tubi per 1 ora. Questo è un potenziale punto di arresto e, se necessario, i campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte.
ATTENZIONE: L'acido tricloroacetico è corrosivo. Si prega di indossare guanti durante la manipolazione per evitare il contatto con la pelle ed evitare l'inalazione.
- Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela il surnatante TCA aspirandolo utilizzando una linea per il vuoto collegata a un puntale per micropipette in vetro fine (lo stesso puntale può essere utilizzato su tutti i campioni). Non disturbare il pellet proteico evitando un'aspirazione pesante e mantenendo una distanza adeguata tra la punta della pipetta e il pellet.
- Lavare rapidamente il pellet con 100 μL di acetone a -20 °C. Questa fase rimuove il TCA residuo dal pellet, che può interferire con il successivo test di Bradford; Tuttavia, l'acetone inizierà a dissolvere il pellet proteico se lasciato a contatto troppo a lungo, quindi l'acetone deve essere aggiunto ed estratto rapidamente dal pellet entro 5 secondi.
- Lasciare evaporare l'acetone posizionando i tubi in una cappa aspirante o in frigorifero. Quindi, sciogliere il pellet proteico aggiungendo 1 mL di NaOH 0,1 M a ciascuna provetta. La dissoluzione completa del pellet può richiedere diversi cicli di riscaldamento in un bagno di acqua calda, vortice e sonicazione.
NOTA: Più a lungo i tubi rimangono nella cappa aspirante o nel frigorifero e più i pellet diventano asciutti, più difficile sarà risolubilizzarli. Si consiglia di asciugare il pellet per 30 minuti, quindi verificare la presenza di acetone ogni 10-15 minuti fino a quando non è chiaro che l'acetone è evaporato (non sono rilevabili fumi di acetone).
- Mescolare soluzioni standard, diluire soluzioni di campioni sconosciuti e quantificare il contenuto proteico totale di campioni sconosciuti utilizzando il saggio di Bradford.
- Preparare soluzioni standard di immunoglobuline G (IgG) bovine secondo le concentrazioni elencate nella Tabella 1 (la soluzione madre liofilizzata o IgG può essere miscelata con acqua deionizzata per raggiungere ciascuna concentrazione). Conservare gli standard a 4 °C. In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 160 μL di ciascuna soluzione standard di IgG in triplicato a partire dalla posizione A1 della piastra a pozzetti (0 μg/μL in posizione A1, A2, A3, 0,0125 μg/μL in posizione B1, B2, B3, ecc.).
- Preparare una soluzione di NaOH diluita aggiungendo 50 μl di NaOH 0,1 M a 950 μl di acqua distillata. Come controllo negativo in bianco, aggiungere 60 μl di questa soluzione alla piastra a pozzetti in triplicato (posizioni G1, G2, G3).
- Preparare le diluizioni di campioni sconosciuti aggiungendo 50 μl di ciascuna soluzione campione a 950 μl di acqua distillata in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Quindi, aggiungere 60 μl di ciascun campione diluito alla piastra a pozzetti in triplicato, iniziando dalla posizione H1. Una piastra a 96 pozzetti dovrebbe consentire l'analisi di 6 standard, 1 bianco e 25 campioni sconosciuti se letta in triplicato. Ogni piastra a pozzetti analizzata deve contenere il proprio standard IgG e campioni bianchi.
- Aggiungere 100 μl di acqua distillata a tutti i pozzetti dei campioni bianchi e sconosciuti. Ora ogni pozzetto dovrebbe contenere un totale di 160 μl. Utilizzando una pipetta multicanale (8 canali), aggiungere 40 μl di colorante proteico blu brillante Coomassie G-250 a ogni pozzetto nella prima colonna della piastra a pozzetti. Mescolare il colorante con i campioni immergendo più volte. Ripetere l'operazione per tutte le altre colonne, sostituendo i puntali delle pipette per evitare contaminazioni.
ATTENZIONE: Coomassie brilliant blue G-250 è irritante e il contatto con la pelle, gli occhi o i polmoni deve essere evitato. Si prega di indossare guanti per evitare il contatto con la pelle. In caso di contatto con la pelle, questo prodotto si macchia.
- Utilizzare un ago per far scoppiare le bolle presenti nei pozzetti, poiché potrebbero interferire con la lettura dello spettrofotometro per micropiastre. Pulire l'ago per evitare la contaminazione tra i pozzetti. Lasciare incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre, registrare i valori di assorbanza per ciascun pozzetto a 595 nm.
Tabella 1. Calcoli della curva standard per il saggio delle proteine solubili.La quantità di proteine in ogni standard viene calcolata prendendo la concentrazione di ogni standard e moltiplicandola per la quantità di soluzione standard in ciascun pozzetto (160 μL).
| Concentrazione di IgG (μg/μL) | Proteine in campioni standard (μg) |
| 0,0000 | 0 |
| 0,0125 | numero arabo |
| 0,0250 | 4 |
| 0,0375 | 6 |
| 0,0500 | 8 |
| 0,1000 | 16 |
