Saggio delle proteine solubili per quantificare il contenuto di proteine solubili nei tessuti vegetali

1. Raccolta e lavorazione delle piante

1. Raccolta ed elaborazione di campioni di piante
   1. Dopo aver raccolto i campioni di piante, congelare i campioni immergendo il materiale vegetale nell'azoto liquido con una pinza e conservarli a -80 °C. Se i campioni di piante raccolti sono troppo grandi per essere congelati, raffreddare rapidamente i campioni con ghiaccio secco e trasferirli in un congelatore a -80 °C il prima possibile. Il contenuto di macronutrienti del materiale vegetale può cambiare dopo che i tessuti sono stati separati dalla pianta, quindi è importante congelare i campioni di piante il prima possibile dopo la raccolta><. ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare gravi congelamenti a contatto con la pelle. Assicurati di trasportare l'azoto liquido in contenitori approvati e di indossare DPI adeguati durante la sua manipolazione, inclusi crio-guanti, occhiali per gli occhi, visiera, grembiule e camice da laboratorio.
   2. Liofilizzare il materiale vegetale utilizzando un liofilizzatore per garantire che i tessuti siano metabolicamente inattivi durante la rimozione dell'acqua. Asciugare fino a quando la massa del campione non si stabilizza per assicurarsi che tutta l'acqua sia stata rimossa.
   3. Una volta che i campioni sono asciutti, macinarli in una polvere fine utilizzando un macinatore o un mulino. Conservare i campioni in una camera di essiccazione fino all'analisi.

2. Saggio delle proteine solubili

1. Preparazione del campione
   1. Pesare campioni replicati di ciascun tessuto, di circa 20 mg ciascuno, in provette per microcentrifuga in polistirene da 1,5 ml e in provette per etichette. Questi campioni saranno successivamente indicati come campioni sconosciuti. Registrare la massa esatta di ciascun campione, poiché queste informazioni saranno necessarie per calcolare la % di proteine solubili in ciascun campione sconosciuto. Utilizzare provette per microcentrifuga con coperchi di bloccaggio, poiché i coperchi non bloccabili potrebbero aprirsi durante la successiva fase di riscaldamento, con conseguente perdita della soluzione campione.
2. Solubilizzare e isolare le proteine del campione sconosciute
   1. Utilizzando un micropipettatore, aggiungere 500 μl di NaOH 0,1 M a ciascuna provetta. Chiudere bene i coperchi e sonicare per 30 minuti. Preriscaldare un bagno di acqua calda 90 °C.
      ATTENZIONE: L'idrossido di sodio è una base forte e può causare ustioni a contatto con la pelle. Sebbene 0,1 M NaOH rappresenti una bassa concentrazione, indossare guanti protettivi per evitare irritazioni cutanee.
   2. Mettere le provette in una griglia nel bagno di acqua calda per 15 minuti.
   3. Centrifugare le provette a 15.000 x g per 10 minuti. Pipettare il liquido surnatante in nuove provette per microcentrifuga etichettate, utilizzando una nuova punta per pipetta per ogni campione. Aggiungere 300 μl di NaOH 0,1 M alla provetta contenente il pellet e centrifugare nuovamente a 15.000 x g per 10 minuti. Anche in questo caso, raccogliere il liquido surnatante e combinarlo con l'altro liquido surnatante dello stesso campione. Questo è un potenziale punto di arresto e, se necessario, i campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte.
3. Precipitare le proteine vegetali
   1. Neutralizzare il pH della soluzione surnatante aggiungendo 11 μl di HCl 5,8 M. Confermare un pH di ~7 immergendo la cartina di tornasole in ciascuna soluzione campione.
      ATTENZIONE: L'acido cloridrico è un acido fortemente corrosivo che può causare ustioni a contatto con la pelle (applicazione cutanea o inalazione). Si prega di indossare guanti per evitare irritazioni cutanee durante la manipolazione dell'HCl.
   2. Aggiungere 90 μl di acido tricloroacetico (TCA) al 100% in ciascuna provetta e incubare le provette con ghiaccio per 30 minuti. La precipitazione delle proteine trasformerà la soluzione da limpida a opaca. Se ciò non si verifica dopo 30 minuti, conservare in frigorifero i tubi per 1 ora. Questo è un potenziale punto di arresto e, se necessario, i campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte.
      ATTENZIONE: L'acido tricloroacetico è corrosivo. Si prega di indossare guanti durante la manipolazione per evitare il contatto con la pelle ed evitare l'inalazione.
   3. Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela il surnatante TCA aspirandolo utilizzando una linea per il vuoto collegata a un puntale per micropipette in vetro fine (lo stesso puntale può essere utilizzato su tutti i campioni). Non disturbare il pellet proteico evitando un'aspirazione pesante e mantenendo una distanza adeguata tra la punta della pipetta e il pellet.
   4. Lavare rapidamente il pellet con 100 μL di acetone a -20 °C. Questa fase rimuove il TCA residuo dal pellet, che può interferire con il successivo test di Bradford; Tuttavia, l'acetone inizierà a dissolvere il pellet proteico se lasciato a contatto troppo a lungo, quindi l'acetone deve essere aggiunto ed estratto rapidamente dal pellet entro 5 secondi.
   5. Lasciare evaporare l'acetone posizionando i tubi in una cappa aspirante o in frigorifero. Quindi, sciogliere il pellet proteico aggiungendo 1 mL di NaOH 0,1 M a ciascuna provetta. La dissoluzione completa del pellet può richiedere diversi cicli di riscaldamento in un bagno di acqua calda, vortice e sonicazione.
      NOTA: Più a lungo i tubi rimangono nella cappa aspirante o nel frigorifero e più i pellet diventano asciutti, più difficile sarà risolubilizzarli. Si consiglia di asciugare il pellet per 30 minuti, quindi verificare la presenza di acetone ogni 10-15 minuti fino a quando non è chiaro che l'acetone è evaporato (non sono rilevabili fumi di acetone).
4. Mescolare soluzioni standard, diluire soluzioni di campioni sconosciuti e quantificare il contenuto proteico totale di campioni sconosciuti utilizzando il saggio di Bradford.
   1. Preparare soluzioni standard di immunoglobuline G (IgG) bovine secondo le concentrazioni elencate nella Tabella 1 (la soluzione madre liofilizzata o IgG può essere miscelata con acqua deionizzata per raggiungere ciascuna concentrazione). Conservare gli standard a 4 °C. In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 160 μL di ciascuna soluzione standard di IgG in triplicato a partire dalla posizione A1 della piastra a pozzetti (0 μg/μL in posizione A1, A2, A3, 0,0125 μg/μL in posizione B1, B2, B3, ecc.).
   2. Preparare una soluzione di NaOH diluita aggiungendo 50 μl di NaOH 0,1 M a 950 μl di acqua distillata. Come controllo negativo in bianco, aggiungere 60 μl di questa soluzione alla piastra a pozzetti in triplicato (posizioni G1, G2, G3).
   3. Preparare le diluizioni di campioni sconosciuti aggiungendo 50 μl di ciascuna soluzione campione a 950 μl di acqua distillata in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Quindi, aggiungere 60 μl di ciascun campione diluito alla piastra a pozzetti in triplicato, iniziando dalla posizione H1. Una piastra a 96 pozzetti dovrebbe consentire l'analisi di 6 standard, 1 bianco e 25 campioni sconosciuti se letta in triplicato. Ogni piastra a pozzetti analizzata deve contenere il proprio standard IgG e campioni bianchi.
   4. Aggiungere 100 μl di acqua distillata a tutti i pozzetti dei campioni bianchi e sconosciuti. Ora ogni pozzetto dovrebbe contenere un totale di 160 μl. Utilizzando una pipetta multicanale (8 canali), aggiungere 40 μl di colorante proteico blu brillante Coomassie G-250 a ogni pozzetto nella prima colonna della piastra a pozzetti. Mescolare il colorante con i campioni immergendo più volte. Ripetere l'operazione per tutte le altre colonne, sostituendo i puntali delle pipette per evitare contaminazioni.
      ATTENZIONE: Coomassie brilliant blue G-250 è irritante e il contatto con la pelle, gli occhi o i polmoni deve essere evitato. Si prega di indossare guanti per evitare il contatto con la pelle. In caso di contatto con la pelle, questo prodotto si macchia.
   5. Utilizzare un ago per far scoppiare le bolle presenti nei pozzetti, poiché potrebbero interferire con la lettura dello spettrofotometro per micropiastre. Pulire l'ago per evitare la contaminazione tra i pozzetti. Lasciare incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 5 minuti.
   6. Utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre, registrare i valori di assorbanza per ciascun pozzetto a 595 nm.

Tabella 1. Calcoli della curva standard per il saggio delle proteine solubili.La quantità di proteine in ogni standard viene calcolata prendendo la concentrazione di ogni standard e moltiplicandola per la quantità di soluzione standard in ciascun pozzetto (160 μL).