Saggio colorimetrico per la quantificazione di carboidrati non strutturali in tessuti vegetali

1. Raccolta e lavorazione delle piante

1. Dopo aver raccolto i campioni di piante, congelare i campioni immergendo il materiale vegetale nell'azoto liquido con una pinza e conservarli a -80 °C. Se i campioni di piante raccolti sono troppo grandi per essere congelati, raffreddare rapidamente i campioni con ghiaccio secco e trasferirli in un congelatore a -80 °C il prima possibile. Il contenuto di macronutrienti del materiale vegetale può cambiare dopo che i tessuti sono stati separati dalla pianta, quindi è importante congelare i campioni di piante il prima possibile dopo la raccolta><. cautela: L'azoto liquido può causare gravi congelamenti a contatto con la pelle. Assicurati di trasportare l'azoto liquido in contenitori approvati e di indossare DPI adeguati durante la sua manipolazione, inclusi crio-guanti, occhiali per gli occhi, visiera, grembiule e camice da laboratorio.
2. Liofilizzare il materiale vegetale utilizzando un liofilizzatore per garantire che i tessuti siano metabolicamente inattivi durante la rimozione dell'acqua. Asciugare fino a quando la massa del campione non si stabilizza per assicurarsi che tutta l'acqua sia stata rimossa.
3. Una volta che i campioni sono asciutti, macinarli in una polvere fine utilizzando un macinatore o un mulino. Conservare i campioni in una camera di essiccazione fino all'analisi.

2. Dosaggio dei carboidrati digeribili

1. Preparazione del campione
   1. Pesare campioni replicati di ciascun tessuto, di circa 20 mg ciascuno, in provette di vetro da 15 ml con tappi a vite rivestiti in gomma (lunghezza 100 mm). Questi campioni saranno successivamente indicati come campioni sconosciuti. Etichettare le provette con un pennarello impermeabile o con nastro adesivo sui coperchi e registrare la massa esatta di ciascun campione, poiché queste informazioni saranno necessarie per calcolare la percentuale di carboidrati in ogni campione sconosciuto.
2. Estrarre i carboidrati digeribili da ogni campione sconosciuto.
   1. Aggiungere 1 mL di 0,1 M H₂SO₄ a ciascuna provetta e avvitare saldamente i tappi sulle provette. Mettere a bagnomaria bollente per 1 ora.
      cautela: L'acido solforico è molto corrosivo. Si prega di indossare guanti, occhiali da vista e un grembiule quando si maneggia H₂SO₄ ed eseguire questo passaggio in una cappa aspirante.
   2. Raffreddare i tubi in un bagno d'acqua tiepida. Versare il contenuto della provetta in provette per microcentrifuga da 1,5 ml etichettate (non preoccuparsi se rimane del materiale vegetale nelle provette di vetro).
   3. Centrifugare le provette a 15.000 x g per 10 minuti. Rimuovere il liquido surnatante con un micropipettatore e inserirlo in nuove provette da microcentrifuga da 1,5 ml etichettate. A questo punto i tubi possono essere refrigerati durante la notte. Se si continua con il saggio, fare riferimento al passaggio 2.3.2.
3. Mescolare soluzioni standard e quantificare il contenuto totale di carboidrati digeribili di campioni sconosciuti.
   1. Preparare soluzioni standard di glucosio D(+) con le concentrazioni elencate nella Tabella 1. Preparare sei provette di vetro con 400 μl di ciascuna soluzione standard.
   2. Pipettare 15 μl di ciascun campione sconosciuto nella propria provetta e aggiungere 385 μl di acqua distillata a ciascuno per un volume totale di 400 μl in ciascuna provetta. In una cappa aspirante, aggiungere 400 μL di fenolo al 5% a ciascuna provetta campione standard e sconosciuta, quindi pipettare rapidamente 2 mL di H₂SO₄ concentrato in ciascuna provetta. Non toccare il contenuto della provetta con la punta della pipetta, basta aggiungerlo alla superficie della soluzione (una pipetta a ripetizione funziona meglio per questo).
   3. Lasciare incubare le provette per 10 minuti, quindi agitare accuratamente le provette per miscelare il contenuto. Incubare per altri 30 minuti.
      cautela: Il fenolo e l'acido solforico sono irritanti corrosivi. Per proteggersi dall'esposizione alla pelle, agli occhi e all'inalazione, questo passaggio deve essere eseguito in una cappa chimica utilizzando i DPI adeguati, che includono: visiera o occhiali per gli occhi, guanti di gomma, grembiule da laboratorio e stivali. La miscelazione del fenolo con l'acido solforico provoca anche una reazione esotermica, che provocherà il surriscaldamento dei tubi.
   4. Pipettare 800 μL di campione da ciascuna provetta in ciascuna delle 3 cuvette semi-micro in polistirene da 1,5 mL (3 repliche tecniche per campione). Impostare lo spettrofotometro in modo che legga a 490 nm. Calibrare su una cuvetta vuota contenente acqua distillata prima di leggere standard o campioni sconosciuti e in modo intermittente durante le letture del campione. Far passare ogni cuvetta attraverso uno spettrofotometro e registrare l'assorbanza. Media delle repliche tecniche per ogni campione sconosciuto.
      nota: In alcuni casi, i campioni possono superare la soglia superiore di assorbanza. In tal caso, i campioni devono essere diluiti al punto 1.3.1. Le diluizioni devono essere prese in considerazione anche nei calcoli successivi.
   5. Calcolare l'assorbanza media per ogni standard.
      nota: Per calcolare la quantità di carboidrati totali digeribili presenti in ogni campione sconosciuto utilizzando la curva standard, è più facile far regredire l'assorbanza media di ogni standard rispetto ai microgrammi di D(+)glucosio presenti in ogni standard, ma si può anche tracciare la concentrazione di D(+)glucosio (μg/μL) di ogni standard, se lo si desidera. I calcoli seguenti, tuttavia, si riferiscono a una curva standard basata su microgrammi, non su concentrazioni (μg/μL).
   6. Calcolare la curva standard tracciando l'assorbanza media rispetto alla quantità totale di D(+)glucosio (μg) in ciascuna soluzione standard. Adattare una linea di regressione lineare a questi dati, quindi utilizzare la seguente equazione per calcolare la quantità totale di carboidrati (μg) in ogni campione sconosciuto:
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = μg di carboidrati nel campione
      A_x = assorbanza media del campione sconosciuto
      b = intercetta y (linea di regressione standard)
      m = pendenza (retta di regressione standard)
      Il coefficiente di correlazione di questa linea dovrebbe essere maggiore di 0,98 e abitualmente vicino a 0,99. Quindi, utilizzare la seguente equazione per determinare la percentuale di carboidrati in ciascun campione:
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c =% carboidrati
      M_i = massa iniziale del campione (mg)

Tabella 1. Calcolo della curva standard per il dosaggio dei carboidrati digeribili. La quantità di glucosio in ogni standard viene calcolata prendendo la concentrazione di ogni standard e moltiplicandola per la quantità di soluzione standard in ciascuna provetta (400 μL)