Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Saggio di crescita del Toxoplasma basato sulla luciferasi
- Seminare fibroblasti del prepuzio umano (HFF) 1 settimana prima dell'inoculazione del parassita per garantire che le cellule ospiti siano completamente confluenti. Eseguire un test simulato in una piastra trasparente per garantire che i parassiti rimangano intracellulari per tutto il periodo di valutazione.
nota: Qui, il test viene condotto in micropiastre a 96 pozzetti. In base alle esigenze sperimentali, può essere scalato fino a 384 o 1536 micropiastre a pozzetti.
- Passare i parassiti Toxoplasma in HFF confluenti 2 giorni prima dell'uso trasferendo ~0,3-0,4 mL di parassiti completamente lisati in un pallone T25. Incubare le cellule ospiti infette a 37 °C con CO2 al 5% per 2 giorni.
- Siringare 5 mL di parassiti appena lisati attraverso un ago di sicurezza da 21 G 5x per liberare i parassiti intracellulari, quindi passare attraverso un filtro da 3 μm per rimuovere i detriti della cellula ospite. Sciacquare i parassiti residui dal pallone utilizzando 7 mL di terreno D10 privo di rosso fenolo, quindi passare nuovamente attraverso il filtro.
- Centrifugare i parassiti a 1000 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT). Versare il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di terreno D10 privo di rosso fenolo.
- Contare i parassiti utilizzando un emocitometro per determinare la concentrazione.
- Diluire i parassiti a 1 x 104 parassiti/mL per il ceppo wild-type (WT). Per i ceppi di parassiti carenti di crescita, aumentare la concentrazione di conseguenza per osservare un aumento significativo dei segnali della luciferasi.
- Aspirare accuratamente i terreni da micropiastre a 96 pozzetti pre-seminati con HFF e inoculare 150 μL di risospensione parassitaria in pozzetti in un formato di tre colonne e cinque righe, che rappresenta tre repliche tecniche e cinque punti temporali.
- Incubare la micropiastra a 37 °C e 5% di CO2 per 4 ore.
- Aspirare accuratamente i terreni dai pozzetti per rimuovere i parassiti non invasi, quindi riempire i pozzetti con terreni privi di rosso fenolo RT in ogni fila (ad eccezione della prima fila).
- Miscelare volumi uguali di PBS e 2 tamponi per il saggio della luciferasi e diluire il substrato della luciferasi a 12,5 μM.
- Aggiungere 100 μl di substrato di luciferasi diluito in ciascun pozzetto della fila superiore. Incubare le micropiastre a RT per 10 minuti per consentire alle cellule di lisarsi completamente.
- Misurare l'attività della luciferasi utilizzando un lettore di micropiastre. Le impostazioni del lettore di piastre sono elencate nella Tabella 1. Ogni lettura rappresenta il numero iniziale di parassiti invasi a 4 ore dall'infezione.
- Ripetere i passaggi 1.9-1.12 per ogni riga ogni 24 ore per 4 giorni senza cambiare il mezzo. Queste letture riflettono il numero totale di parassiti replicati a 24 ore, 48 ore, 72 ore e 96 ore dopo l'infezione.
- Calcola le letture medie in ogni punto temporale e dividile per le letture medie a 4 ore per determinare le variazioni di piega nella crescita del parassita nel tempo.
- Traccia i dati utilizzando un software grafico.
- Per calcolare il tempo di raddoppio, tracciare i valori log2 delle variazioni di piega nei singoli punti temporali durante il tempo di incubazione. Utilizzare una funzione di regressione lineare per calcolare la pendenza, che rappresenta il tempo di raddoppio di ogni deformazione.
Tabella 1: Impostazioni del lettore di micropiastre per la misurazione dell'attività della luciferasi durante il saggio di crescita del Toxoplasma basato sulla luciferasi
| Luciferase: | Endpoint |
| Tempo di integrazione: | 1 s |
| Set di filtri - Emissione: | Luce piena |
| ottica: | In alto |
| guadagnare: | 135 |
| Velocità di lettura: | normale |
| ritardo: | 100 metri quadrati |
| Altezza di lettura: | 4,5 millimetri |
