Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Valutazione dell'efficacia dell'inibizione dei composti chimici contro la crescita del Toxoplasma
NOTA: Qui, la valutazione dell'inibizione di LHVS nella crescita del Toxoplasma è presentata come esempio. Vengono testate otto diverse concentrazioni di LHVS e vengono eseguite tre repliche tecniche per ciascuna delle tre repliche biologiche per entrambi i ceppi RHΔku80::NLuc e RHΔku80Δcpl::NLuc.
- Prima dell'infezione parassitaria, seminare HFF in micropiastre a 96 pozzetti nel formato di tre righe e nove colonne per una replica biologica per composto per ceppo. Le cellule ospiti saranno lasciate crescere per almeno 7 giorni prima dell'uso.
- Passare i parassiti RHΔku80::NLuc e RHΔku80Δcpl::NLuc per 2 giorni prima dell'uso.
- Passare i parassiti Toxoplasma in HFF confluenti 2 giorni prima dell'uso trasferendo ~0,3-0,4 mL di parassiti completamente lisati in un pallone T25. Incubare le cellule ospiti infette a 37 °C con CO2 al 5% per 2 giorni.
- Siringare 5 mL di parassiti appena lisati attraverso un ago di sicurezza da 21 G 5x per liberare i parassiti intracellulari, quindi passare attraverso un filtro da 3 μm per rimuovere i detriti della cellula ospite. Sciacquare i parassiti residui dal pallone utilizzando 7 mL di terreno D10 privo di rosso fenolo, quindi passare nuovamente attraverso il filtro.
- Centrifugare i parassiti a 1000 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT). Versare il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di terreno D10 privo di rosso fenolo.
- Contare i parassiti utilizzando un emocitometro per determinare la concentrazione.
- Diluire i parassiti a 1 x 104 parassiti/mL per il ceppo wild-type (WT). Per i ceppi di parassiti carenti di crescita, aumentare la concentrazione di conseguenza per osservare un aumento significativo dei segnali della luciferasi.
- Risospendere i parassiti in terreni privi di rosso fenolo a 1 x 104 parassiti/mL.
- Aspirare il terreno da una piastra contenente HFF confluenti e inoculare in ciascun pozzetto 150 μl di risospensione antiparassitaria. Incubare la micropiastra a 37 °C e 5% di CO2 per 4 ore.
- Preparare LHVS a otto diverse concentrazioni in un serbatoio a 12 pozzetti mediante diluizione seriale. Generalmente, le concentrazioni vengono ridotte di tre volte in modo da diluire serialmente.
nota: La concentrazione più bassa viene ridotta di 6.561 volte rispetto alla concentrazione più alta. La variazione di piega della diluizione può essere regolata di conseguenza in base alle diverse proprietà dei singoli composti.
- A 4 ore dall'infezione, aspirare il terreno per rimuovere i parassiti non invasi e riempire ciascun pozzetto dalle colonne 2-9 con 150 μL di terreno integrato con LHVS a diverse concentrazioni. Lasciare la prima colonna riempita con terreno normale per fungere da controllo non trattato.
- Incubare la micropiastra a 37 °C e 5% di CO2 per altre 96 ore.
- Aspirare accuratamente i terreni dai pozzetti per rimuovere i parassiti non invasi, quindi riempire i pozzetti con terreni privi di rosso fenolo RT in ogni fila (ad eccezione della prima fila).
- Miscelare volumi uguali di PBS e 2 tamponi per il saggio della luciferasi e diluire il substrato della luciferasi a 12,5 μM.
- Aggiungere 100 μl di substrato di luciferasi diluito in ciascun pozzetto della fila superiore. Incubare le micropiastre a RT per 10 minuti per consentire alle cellule di lisarsi completamente.
- Misurare l'attività della luciferasi dei singoli pozzi.
- Fare la media delle attività luciferasiche di tre repliche tecniche da pozzi di ogni singola concentrazione di LHVS.
- Dividere l'attività media della luciferasi per ciascuna concentrazione di LHVS per l'attività media della luciferasi derivata da parassiti non trattati per calcolare l'attività normalizzata della luciferasi in percentuale.
- Tracciare le attività normalizzate della luciferasi rispetto alle singole concentrazioni di LHVS utilizzando un software grafico (Figura 1). Anche l'inibizione della pirimetamina contro la crescita dei parassiti è misurata come controllo. La pirimetamina è un antibiotico clinico usato per trattare la toxoplasmosi acuta inibendo il metabolismo dell'acido folico nel Toxoplasma.
- Calcolare i valori IC50 per i singoli composti utilizzando il metodo incorporato nel software grafico, risposta normalizzata rispetto a [inibitore], nell'ambito del programma di regressione "dose-risposta-inibizione". L'IC50 viene calcolato utilizzando la seguente formula:
Y = 100/(1 + X/IC50)
Dove: Y rappresenta l'attività normalizzata della luciferasi delle cellule infette a diverse concentrazioni di inibitore e X rappresenta le concentrazioni individuali di inibitore.
