Dosaggio della β-galattosidasi per valutare la citotossicità indotta da farmaci nei parassiti

In questo articolo

Abstract

Fonte: Alonso, V. L. et al. In vitro Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, descriviamo un metodo semplice e robusto per determinare il potenziale citotossico di un farmaco tripanocida contro un parassita, il Trypanosoma cruzi, che esprime l'enzima β-galattosidasi. La β-galattosidasi funge da indicatore di lisi cellulare e la sua attività può essere utilizzata per valutare gli effetti del farmaco.

Protocollo

1. Saggio della β-galattosidasi

NOTA: La quantificazione dell'attività della β-galattosidasi viene utilizzata come metodo indiretto per determinare il numero di parassiti. Si prevede che la crescita sarà inibita in presenza di un composto tripanocida, portando a un numero inferiore di parassiti rispetto al controllo non trattato, che si rifletterà in una minore attività β-galattosidasi e quindi in una minore assorbanza.

Incubare i parassiti con BZN
1. Aggiungere 100 μL della corrispondente soluzione 2x benznidazolo (BZN) per pozzetto per raggiungere una concentrazione finale di BZN di 80, 40, 20, 10, 5 e 2,5 μM a 100 μL di sospensione di epimastigote, cellule Vero con amastigoti (2 giorni dopo l'infezione) o tripomastigoti in una piastra a 96 pozzetti.
2. Incubare gli epimastigoti a 28 °C per 72 ore e i tripomastigoti o le cellule di Vero infettate con amastigoti per 24 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
  nota: Ogni concentrazione di farmaco deve essere valutata almeno in triplicato e includere colture di controllo di epimastigoti, tripomastigoti e cellule Vero infettate con dimetilsolfossido (DMSO).
Reazione colorimetrica
1. Dopo il periodo di incubazione del trattamento, se le cellule Vero o i tripomastigoti infetti si trovano nel terreno di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco con rosso fenolo, sostituire il terreno con 100 μL di 1x PBS per evitare interferenze. Eseguire pozzetti in bianco triplicato contenenti solo 100 μL di terreno corrispondente (o 1x PBS a seconda dei casi).
  nota: Non è necessario rimuovere il terreno di coltura per gli epimastigoti in caso di terreno LIT o DMEM senza rosso fenolo. Il DMEM con rosso fenolo può ancora essere utilizzato; preparare un pozzetto in bianco con il solo DMEM per misurare l'assorbanza di base e quindi sottrarre questo valore durante l'analisi dei dati. Il medium per insetti di Schneider, che è incolore, è un'alternativa agli epimastigoti.
2. Aggiungere 40 μL di soluzione di substrato di clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside (CPRG) e 10 μL della soluzione detergente a ciascun pozzetto, ottenendo una concentrazione finale di 200 μM CPRG e lo 0,1% di detergente in un volume finale di 250 μL in ciascun pozzetto.
  nota: La soluzione CPRG e il detergente possono essere aggiunti insieme in un volume finale di 50 μl per pozzetto.
3. Incubare a 37 °C per 2 ore e misurare l'assorbanza a 595 nm in uno spettrofotometro per micropiastre.
  nota: Il cambiamento di colore atteso è da giallo a bruno-rossastro dopo scissione enzimatica della β-galattosidasi (Figura 1A). Il tempo di incubazione può essere esteso fino a 4 ore e gli spettri di assorbanza del rosso clorofenolo possono essere letti tra 570 e 595 nm con un adattamento della curva simile. L'incubazione fino a 24 ore in presenza di substrato CPRG ha mostrato adattamenti di curva simili.

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Risultati

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Figura 1: Calcolo del valore IC50 del benznidazolo per l'epimastigote forma Dm28c. (A) Una piastra a 96 pozzetti con epimastigoti trattati con diverse concentrazioni di BZN (2,5, 5, 10, 20, 40 e 80 μM) prima dell'aggiunta di CPRG (1), dopo l'aggiunta iniziale di CPRG e detergente (2) e dopo l'incubazione con CPRG e detergente che mostrano il cambiamento di colore (3). (B