Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Rilascio di monoammine endogene ex-vivo da fette di cervello o punch
NOTA: Il dispositivo utilizzato per questa sezione è costituito da una piastra da 48 pozzetti e un supporto per tessuti costituito da sei unità filtranti per microcentrifuga senza i filtri inseriti collegati a una linea di carbogeni (Figura 1). Per realizzare il supporto, utilizzare una robusta asta di plastica (ad esempio, da un raschietto per celle) e incollare le unità filtranti della microcentrifuga senza i filtri incorporati su di essa. Lasciate asciugare per 1-2 giorni. Il tempo necessario per l'esperimento di rilascio endogeno di monoammine e le concentrazioni di anfetamina, fluoxetina e cocaina si basano sulla letteratura attuale e sui protocolli precedenti.
- Attivazione tissutale
- Trasferire il tessuto cerebrale in ciascun pozzetto della camera di efflusso e consentire il recupero per 30-50 minuti a 37 °C su uno scaldavetrini in 0,5-1 mL di tampone di efflusso ossigenato, con gorgogliamento costante e delicato (Figura 1B1).
- Durante questa incubazione, diluire i farmaci alla concentrazione desiderata per l'esperimento. Tutti i farmaci devono essere disciolti in tampone di efflusso e le concentrazioni si basano sulla letteratura attuale.
- Prima incubazione
- Spostare il portafazzoletti con il tessuto cerebrale in pozzetti contenenti 500 μl di tampone di efflusso ossigenato e incubare per 20 minuti a 37 °C. Assicurarsi che venga trasportato un tampone minimo o nullo picchiettando il supporto sul bordo del pozzetto fino a quando non vi si trova più un eccesso di tampone.
- Negli esperimenti con agenti farmacologici come gli inibitori dei trasportatori delle monoammine, incubare i campioni di tessuto con i farmaci diluiti in tampone di efflusso ossigenato (ad esempio, 10 μM di fluoxetina, 40 μM di cocaina; vedi Figura 1B2). Il volume finale in ciascun pozzetto sarà di 500 μL.
- Seconda incubazione
- Spostare il supporto con il tessuto in una nuova serie di pozzetti contenenti 500 μL di tampone di efflusso totale con o senza la concentrazione desiderata di ciascun farmaco. Assicurarsi che non sia rimasto alcun buffer in eccesso. Ogni pozzetto rappresenta un n= 1 per le condizioni sperimentali. Ogni condizione sperimentale viene eseguita in triplicato.
- Un pozzetto include un tampone di efflusso ossigenato, il successivo 10-30 μM di AMPH e il pozzetto finale include 10-30 μM di AMPH più inibitori del trasportatore delle monoammine. Ogni farmaco è disciolto in un tampone di efflusso ossigenato.
- Incubare il tessuto per 20 minuti a 37 °C con 500 μL del farmaco Condition.
nota: Ulteriori pozzetti possono includere un tampone ossigenato ad alto efflusso di K+ con o senza gli inibitori del trasportatore delle monoammine. Sciogliere ciascun farmaco nel tampone di efflusso ossigenato (500 μL).
- Durante questa seconda incubazione di 20 minuti, prelevare la soluzione dai pozzetti della prima incubazione della fase 1.2.1 e trasferirla in provette da microcentrifuga contenenti 50 μl di acido perclorico 1 N o acido fosforico (a seconda del tipo di HPLC, concentrazione finale 0,1 N). Il volume finale del campione sarà di 550 μl. Mantenere le provette per microcentrifuga sul ghiaccio ed etichettare le provette #1.
- Dopo la seconda incubazione di 20 minuti, spostare il supporto del tessuto con sezioni cerebrali o punzoni in un pozzetto vuoto e mantenere la piastra sul ghiaccio. Trasferire il surnatante in provette da microcentrifuga contenenti 50 μl di acido perclorico 1 N o acido fosforico. Il volume finale del campione sarà di 550 μL. Mantenere le provette per microcentrifuga sul ghiaccio ed etichettare le provette #2.
- Aggiungere 1 mL di tampone di dissezione ghiacciato in ciascun pozzetto contenente tessuto. Raccogliere tutto il tessuto utilizzando piccole pinzette e trasferirlo in provette da microcentrifuga pulite.
- Mantenere le provette con tessuto cerebrale a -80 °C. Scartare 1 mL di tampone di dissezione (Figura 1B4).
- Soluzioni filtranti ottenute da ogni incubazione utilizzando provette filtranti per microcentrifuga (0,22 μm) a 2.500 x g per 2 minuti. Utilizzare il filtrato per determinare il contenuto di monoammine utilizzando HPLC con rivelazione elettrochimica (Figura 1B5).
