Tutte le procedure per animali qui descritte sono state approvate dalla Icahn School of Medicine presso il comitato istituzionale e di utilizzo del Mount Sinai.
1. Preparazione prima dell'isolamento delle cellule valvolari da topi adulti
- Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici mostrati nella Figura 1A utilizzando etanolo al 70% v/v e successivamente sterilizzandoli in autoclave per 30 minuti. Pulire l'area di lavoro chirurgica con etanolo al 70%.
- Aggiungere 500 μL di penicillina-streptomicina a 50 mL di HEPES da 10 mm. Preparare un'aliquota di 50 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS). Mantieni le soluzioni in ghiaccio.
- Preparare soluzioni di collagenasi da 1 mg/mL e 4,5 mg/mL e utilizzare 5 mL di ciascuna soluzione in provette da 15 mL per eseguire l'intera procedura. Per preparare 5 mL di 1 mg/mL di collagenasi, mescolare 5 mg di collagenasi con 2,5 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, fetal bovine serum (FBS)-free) e 2,5 mL di 10 mM di HEPES integrati con antibiotici (1% penicillina-streptomicina dal passaggio 1.2). Filtrare le soluzioni attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere qualsiasi contaminazione.
NOTA: Conservare le soluzioni in ghiaccio per proteggere gli enzimi.
- Riscaldare la soluzione DMEM a 37 °C prima dell'uso in tutti i passaggi descritti di seguito. Preparare il terreno completo integrando DMEM con l'1% di penicillina-streptomicina, l'1% di piruvato di sodio, 5 mL di 200 mM di L-glutammina, 1 mL di reagente per l'eliminazione del micoplasma (vedere la Tabella dei materiali) e il 10% di FBS.
2. Isolamento delle celle valvolari
- Per ottenere 105 cellule per l'esperimento, utilizzare cinque topi di 8 settimane (minimo tre). Mettere il topo in una camera di induzione insieme a un piccolo pezzo di carta velina imbevuto di 1 mL di isoflurano, ma non permettere il contatto con il tessuto. Confermare che l'animale sia completamente anestetizzato; Verificare la presenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi, quindi sopprimere il topo mediante lussazione cervicale. Utilizzare l'isoflurano per alleviare qualsiasi dolore prima della lussazione cervicale poiché la procedura descritta di seguito è terminale.
- Posiziona il mouse su una piattaforma di dissezione e fissa le zampe con le cannule per tenerlo in posizione. Pulire il torace e l'addome con etanolo; Aprire l'addome e il torace con le forbici. Con piccole forbici chirurgiche, tagliare tra l'atrio sinistro e il ventricolo sinistro per dissanguare il topo. Perfondere il cuore con 10 ml di PBS freddo per rimuovere il sangue dal cuore.
- Tagliare il cuore e mantenere 3 mm dall'aorta ascendente come mostrato nella Figura 1B. Sezionare la valvola aortica con uno stereomicroscopio. Tagliare il cuore orizzontalmente al centro dei ventricoli (Figura 1C). Tagliare il ventricolo sinistro verso l'aorta e sezionare con cura la valvola aortica (Figura 1D-F). Raggruppare le valvole in un piccolo piatto di coltura tissutale da 35 mm.
- Lavare le valvole isolate in una piastra di coltura cellulare da 75 mm con 5 mL di HEPES freddo (10 mM) integrato con antibiotici (1% penicillina-streptomicina) per rimuovere il sangue (Figura 2). Preparare due provette da 15 mL di collagenasi 1 mg/mL e 4,5 mg/mL come descritto sopra al punto 1.3.
nota: Dopo la dissezione, manipolare le valvole isolate in una cappa di biosicurezza sterile per ridurre al minimo la contaminazione.
- Incubare le valvole in collagenasi di tipo I (1 mg/mL) per 30 minuti a 37 °C agitando continuamente (Figura 2). Centrifugare la provetta per 5 minuti a 150 × g, lavare il pellet una volta con 2 mL di HEPES (10 mM) e agitare per 30 s ad alta velocità. Versare il contenuto di questa provetta in un piatto di coltura da 35 mm e trasferire con cura i frammenti di tessuto utilizzando una pinzetta sottile in una nuova provetta.
nota: In questa fase, i VIC non sono ancora dissociati dal tessuto e il pellet contiene pezzi di tessuto. Per evitare la contaminazione con le cellule endoteliali, non centrifugare dopo il vortex al punto 2.5.
- Incubare il pellet in una provetta da 15 mL con 5 mL di collagenasi di tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C in agitazione continua per 35 min. Risospendere le cellule con una pipetta da 1 mL per separare le cellule e centrifugare a 150 × g per 5 min a 4 °C.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di DMEM completo. Centrifugare a 150 × g per 5 minuti a 4 °C. Ripetere questo passaggio due volte per pulire le cellule.
nota: Il pellet avrà ancora alcuni frammenti di tessuto.
- Risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo e piastrarle in un pozzetto di una piastra per colture cellulari a 6 pozzetti in una quantità minima di terreno per facilitare il loro attaccamento alla piastra di coltura. Lasciare le cellule, indisturbate, in un incubatore a 37 °C con il 5% di anidride carbonica.
- Dopo 3 giorni, controlla le cellule al microscopio per verificare una buona crescita vicino ai detriti di tessuto. Una volta che 1.000 cellule sono visibili al microscopio, rimuovere con cura i detriti di tessuto con una pinzetta autoclavata e cambiare il mezzo.
nota: La piastra non deve essere disturbata; Se non si rispetta il numero richiesto di cellule, rimettere la piastra di coltura cellulare nell'incubatore per altri 2 giorni.
- Quando le cellule sono confluenti al 70% (2,5 × 105), tripsinizzarle e poi trasferirle in una piastra di coltura tissutale da 75 mm.
3. Saggio di calcificazione in vitro
- Pulire la cappa con etanolo al 70%, riscaldare il fluido DMEM a 37 °C.
- Seminare 100.000 cellule/condizione in piastre a 6 pozzetti in DMEM completo e coltura per 24 ore a 37 °C.
- Preparare il terreno calcificante mescolando 2 mM di NaH2PO4, 10-7 M di insulina e 50 μg/mL di acido ascorbico in DMEM con il 5% di FBS. Per 93 mL di DMEM, aggiungere 5 mL di FBS, 1 mL di antibiotici (concentrazione finale 1%), 1 mL di piruvato di sodio (100 mM), 27,5 mg di NaH2PO4, 5,8 μL di insulina e 5 mg di acido ascorbico.
NOTA: Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 μm prima dell'uso.
- Dopo 24 ore, sostituire il mezzo surnatante con il mezzo calcificante. Incubare le cellule per 7 giorni a 37 °C. Il 3° giorno, sostituire con un terreno calcificante fresco e riposizionare la piastra nell'incubatrice per completare i 7 giorni di trattamento.
- Dopo 7 giorni, rimuovere il terreno e lavare le cellule due volte con 2 ml di 1x PBS. Incubare le cellule in 1 mL di acido cloridrico 0,6 N (HCl) per 24 ore a 37 °C. Raccogliere l'HCl in una provetta da 1,5 mL e farla evaporare in un evaporatore rotante. Risospendere il contenuto di tutte le provette in 60 μL di HCl.
nota: La procedura di essiccazione è importante per concentrare la soluzione e avere lo stesso volume per ogni condizione.
- Utilizzare una piastra a 96 pozzetti per misurare la concentrazione di calcio utilizzando il reagente Arsenazo III, disponibile in un kit pronto all'uso (vedere la Tabella dei materiali per maggiori dettagli).
- Preparare una soluzione standard di calcio con una concentrazione di 10 mg/dL. Pesare 10 mg di idrossido di calcio (Ca(OH)2) e sciogliere in 100 mL di acqua distillata.
- In una piastra trasparente da 96 pozzetti, pipettare 2 μL di soluzione bianca (HCl, 0,6 N), la soluzione standard, il campione per pozzetto (10 mg/dL) e i campioni. Eseguire l'esperimento in triplicato per verificare la variabilità del pipettaggio. Aggiungere 200 μl di reagente per ogni condizione.
nota: I campioni superiori a 15 mg/dL devono essere diluiti 1:1 con soluzione fisiologica, saggiati nuovamente e il risultato moltiplicato per due.
- Incubare la reazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
nota: La reazione è stabile per 60 min.
- Leggi e registra l'assorbanza della piastra a 650 nm. Utilizzare la seguente formula per calcolare la quantità di calcio nei campioni:
Calcio (mg/mL) = (Assorbanza del campione/assorbanza dello standard) × Concentrazione dello standard
