Saggio di immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA mediato da PM2,5 negli embrioni di pesce

Abstract

Fonte: Huang, Y., et al. Utilizzo dell'immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM_2,5 nei cuori di embrioni di zebrafish. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra un test altamente sensibile basato sull'immunofluorescenza per rilevare il danno ossidativo indotto da PM_2,5 nel cuore di embrioni di zebrafish misurando i livelli di 8-OHdG e γH2AX, che indicano rispettivamente il danno al DNA e le rotture del DNA a doppio filamento.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Campionamento PM_2.5 ed estrazione di composti organici

NOTA: Il PM_2.5 è stato raccolto in un'area urbana a Suzhou, Cina, dall'1 al 7 agosto 2015, come descritto in precedenza.

1. Cuocere i filtri a membrana al quarzo da 47 mm in un forno a muffola a 500 °C per 2 ore per rimuovere i componenti organici.
2. Posizionare un filtro in un campionatore PM_2,5 per 24 ore di campionamento ininterrotto.
3. Rimuovere il filtro e asciugare per 24 ore a temperatura ambiente.
4. Quantificare il filtro con una bilancia analitica.
5. Estrarre i componenti organici dal filtro mediante estrazione Soxhlet utilizzando il diclorometano come solvente.
6. Essiccare l'EOM mediante evaporazione rotativa in un bagno d'acqua a 60 °C e flusso di azoto. Sciogliere EOM in DMSO e conservare a -20 °C.

2. Raccolta e trattamento degli embrioni di pesce zebra

1. Mantenere il pesce zebra a 28,5 ± 0,5 °C in un sistema di acquacoltura a ricircolo con un ciclo di fotoperiodo di 14 ore di luce e 10 ore di buio.
2. Mettete il pesce zebra adulto sano in una vasca con un rapporto maschio-femmina di 2:1.
3. Il giorno successivo, raccogli gli embrioni e lavali con acqua di sistema (cioè acqua di riproduzione del pesce zebra).
4. Selezionare e dividere casualmente gli embrioni di zebrafish che dimostrano uno sviluppo normale (dimensioni uniformi, chicchi pieni e nessuna coagulazione delle uova) in 4 gruppi in singole piastre di Petri di vetro con un diametro di 7 cm (circa 50 embrioni per piastra).
5. Trattare gli embrioni con PM_2,5 (5 mg/L) in presenza o assenza di NAC a 0,25 μM da 2 hpf fino a 72 hpf. Utilizzare il DMSO come controllo del veicolo fino a una concentrazione finale allo 0,1% (v/v).

3. Osservazione morfologica di embrioni di zebrafish e dissezione cardiaca

1. A 72 hpf, trasferire gli embrioni su vetrini e osservare al microscopio stereoscopico. Registrare malformazioni cardiache, come edema pericardico, loop alterato e riduzione delle dimensioni.
2. Calcola i tassi di malformazione (la percentuale di embrioni con difetti cardiaci sul totale degli embrioni viventi) e analizza le differenze tra i gruppi utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo della Turchia (p < 0,05 = statisticamente significativo).
3. Anestetizzare gli embrioni con 0,6 mg/mL di MS-222 per immobilizzarli su vetrini.
4. Registra i battiti cardiaci per 30 s e quantifica la frequenza cardiaca utilizzando il software ImageJ.
5. Seziona i cuori dagli embrioni di pesce zebra con un ago per siringa usa e getta sotto uno stereomicroscopio. Attenzione: Evitare di distruggere la forma del cuore.

4. Saggio di immunofluorescenza

1. Per utilizzare un test di immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM_2,5 nel cuore di embrioni di zebrafish, utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio su un lato di vetro pulito.
2. Aggiungere 50 μL di paraformaldeide al 4% a 1,25 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere una soluzione fissativa.
3. Posizionare 3 cuori sezionati in un cerchio di recinto barriera idrofobica e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
4. Decantare la soluzione al microscopio e asciugare i campioni a temperatura ambiente per almeno 5 minuti, in modo che i cuori si attacchino completamente ai vetrini.
5. Lavare i vetrini tre volte in PBS con lo 0,1% di Tween 20 (PBST) per 5 minuti per lavaggio.
6. Aggiungere 50 μL di albumina sierica bovina (BSA) a 1000 μL di PBST per ottenere una soluzione di BSA al 5% e incubare i vetrini in una camera umida per 1 ora per bloccare il legame degli anticorpi non specifici.
7. Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBST per 5 minuti per lavaggio.
8. Diluire 2 μL di anticorpo monoclonale di topo contro 8-OHdG e 2 μL di anticorpo policlonale di coniglio contro γH2AX in 296 μL di PBST per ottenere una soluzione di cocktail di anticorpi primari funzionante.
9. Incubare i campioni cardiaci con 50 μl della soluzione di cocktail di anticorpi primari contro 8-OHdG e γH2AX in una camera umidificata per almeno un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C (l'incubazione notturna può aumentare l'intensità del segnale).
10. Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBST per 5 minuti per lavaggio.
11. Diluire 1 μL di anticorpo secondario anti-topo di capra marcato con FITC e 1 μL di anticorpo secondario anti-coniglio di capra cy3 in 498 μL di PBST per ottenere una soluzione di cocktail di anticorpi secondari funzionante e incubare i campioni con gli anticorpi secondari (1:500 in PBST) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
12. Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBS per 5 minuti per lavaggio al riparo dalla luce.
13. Aggiungere 20 μL di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo) ai campioni per la colorazione nucleare per 30 minuti a temperatura ambiente.
14. Applicare un vetrino coprioggetti per far scorrere e sigillare con smalto per evitare l'essiccazione e il movimento. Quindi visualizza i campioni al microscopio a fluorescenza e quantifica il segnale di fluorescenza dell'area cardiaca utilizzando il software ImageJ. Calcolare le variazioni relative con la media dei campioni di controllo DMSO. Determinare la significatività statistica dei dati come al punto 3.2.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo 8-OHdG	Santa Cruz Biotechnology, Stati Uniti	SC-66036	Anticorpi primari
Bilancia analitica	Sartorius, Cina	BSA124S
Bsa	Solarbio, Pechino, Cina	SW3015	Per il blocco
DAPI	Abcam, Stati Uniti	ab104139	Per controcolorante nucleare.
Dmso	Solarbio, Pechino, Cina	D8371
Microscopio a fluorescenza	Olimpo, Giappone	IX73	Per l'imaging di segnali di fluorescenza
IgG Cy3 anti-coniglio di capra	Carlsbad,Stati Uniti	CW0159	Anticorpo secondario
IgG FITC anti-coniglio di capra	Carlsbad,Stati Uniti	RS0003	Anticorpo secondario
N-acetil-L-cisteina (NAC)	Adamas-Beta, Shanghai, Cina	616-91-1
Agitatore orbitale	QILINBEIER,Cina	TS-1
Paraformaldeide	Sigma, Cina	P6148	Prepara il 4% di paraformaldeide per il fissaggio.
Soluzione salina tamponata con fosfato	HyClone,Stati Uniti	SH30256.01	Preparare lo 0,1% di interpolazione in PBS per il lavaggio.
Campionatore PM2.5	TianHong, Wuhan, Cina	TH-150C	Per il campionamento ininterrotto di PM2,5 24 ore su 24.
Sistema di acquacoltura a ricircolo	HaiSheng, Shanghai, Cina		Il pesce zebra era mantenuto in esso.
Estrattore Soxhlet	ZhengQiao,Shanghai, Cina	BSXT-02	Per l'estrazione di componenti organici.
Stereomicroscopio	Nikon, Canada	SMZ645	Per la dissezione cardiaca da embrioni di zebrafish.
Tricaina metanosolfonato (MS222)	Sigma, Cina	E10521	Per anestetizzare embrioni di zebrafish
Interpolazione 20	Sigma, Cina	P1379
Anticorpo γH2AX	Abcam, Stati Uniti	ab26350	Anticorpi primari