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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle fette di corteccia rinale-ippocampo
NOTA: La preparazione delle fette di corteccia rinale-ippocampo utilizza ratti P6-7 Sprague-Dawley.
- Impostazione della coltura e preparazione del terreno
- Il giorno prima della coltura, preparare il terreno necessario e posizionarlo a 4 °C.
- Preparare il terreno di dissezione: 25 mM di glucosio nella soluzione salina bilanciata (GBSS) di Gey.
- Preparare il terreno di coltura: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% siero di cavallo (HS), 25 mM di glucosio, 30 μg/mL di gentamicina.
- Preparare il terreno di mantenimento: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM di L-glutammina, 30 μg/mL di gentamicina, HS (15%, 10%, 5% e 0%).
- Raccolta di cervelli
- Poco prima di iniziare la coltura, aggiungere 1,1 mL di terreno di coltura a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti con una pipetta P1000 e posizionarla a 37 °C.
- Posizionare tutta l'attrezzatura (microscopio di dissezione, tritatessuti, lampada da dissezione, strumenti di dissezione, elettrodi, piastre, inserti e carta da filtro) all'interno della cabina di sicurezza biologica e sterilizzare sotto la luce UV per 15 minuti.
- Regolare lo spessore della fetta a 350 μm.
- Estrarre il GBSS dal frigorifero. Aggiungere 5 ml di GBSS a sei piastre di Petri. Saranno necessarie sei piastre di Petri per animale.
- Sopprimere il cucciolo di ratto. Esegui la decapitazione usando una forbice affilata alla base del tronco cerebrale dell'animale.
- Lavare la testa dell'animale tre volte in GBSS freddo e portarla all'interno dell'armadio di sicurezza.
- Isolamento tissutale e preparazione delle fette
- Inserire saldamente una pinza affilata nelle orbite dell'occhio per tenere la testa.
- Con una forbice sottile, tagliare la pelle/cuoio capelluto lungo la linea mediana partendo dal forame vertebrale verso i lobi frontali e metterla da parte.
- Tagliare allo stesso modo il cranio e lungo la fessura trasversale cerebrale (spazio tra cervello e cervelletto). Con una pinza lunga curva, allontanarla.
- Scartare i bulbi olfattivi con una spatola. Rimuovi il cervello dalla testa e mettilo in GBSS ghiacciato con la superficie dorsale rivolta verso l'alto (Figura 1A).
- Inserire la pinza sottile nel cervelletto e percorrere la linea mediana con la spatola aprendo ogni emisfero con molta attenzione (Figura 1B).
- Con una pinza a curva corta, rimuovere con cura il tessuto in eccesso che copre l'ippocampo, senza toccare la struttura dell'ippocampo. Quindi, con una spatola, tagliare sotto ogni ippocampo (Figura 1C).
- Prendi un emisfero e posizionalo, con l'ippocampo rivolto verso l'alto, su una carta da filtro. Ripetere la procedura con l'altra semisfera e posizionarla parallelamente al primo, nella carta da filtro. Mettere la carta da filtro sul tritatutto, con gli emisferi perpendicolari alla lama, e tagliare gli emisferi a fette da 350 μm (Figura 1D).
- Mettere il fazzoletto affettato in una capsula di Petri con GBSS freddo (Figura 1E).
- Separare accuratamente le fette utilizzando gli elettrodi a punta tonda (Figura 1F). Conservare solo le fette con corteccia renale e ippocampo strutturalmente intatti. Le aree DG e CA dovrebbero essere perfettamente definite, così come la corteccia entorinale e peririnale (Figura 1G).
- Posizionare ogni fetta sull'inserto (Figura 1H-I), con una spatola e un elettrodo a punta tonda. Rimuovere il mezzo di dissezione in eccesso attorno a ciascuna fetta con una pipetta P20 (Figura 1J). Quattro fette di corteccia rinale-ippocampo possono essere coltivate in un unico inserto (Figura 1K).
- Manutenzione della coltura
- Cambia il mezzo a giorni alterni.
- Riscaldare il fluido a 37 °C.
- Prendi i piatti dall'incubatrice. Prelevare ciascun inserto tenendo il bordo di plastica con una pinza (Figura 1L).
- Utilizzare una mano libera per aspirare il terreno dal pozzo. Riposizionare l'inserto nel pozzetto e aggiungere 1 mL, con una pipetta P1000, di terreno fresco riscaldato (Figura 1M). Ripetere l'operazione per tutti gli inserti. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate tra la membrana e il fluido.
nota: Le fette di tipo epilettico subiscono una graduale e controllata privazione di siero nel terreno. A partire da 9 giorni in vitro, le fette vengono mantenute in NBA senza HS.
2. Registrazioni elettrofisiologiche
NOTA: Le registrazioni elettrofisiologiche sono state eseguite in sezioni organotipiche di corteccia rinale-ippocampo a 7, 14 e 21 DIV in una camera di interfaccia. Le registrazioni sono state ottenute con un amplificatore, digitalizzate e analizzate con un software. Tutte le registrazioni sono state filtrate passa-banda (filtro di Bessel a otto poli a 60 Hz e filtro gaussiano a 600 Hz).
- Preparazione dell'installazione
- Preparare 50 ml di terreno NBA con 1 ml di B27 e 250 μL di L-glutammina. Riscaldare a 37 °C.
- Impostare la configurazione dell'elettrofisiologia in un circuito chiuso. Verificare se la velocità di flusso è di 2 mL/min.
- Aprire la valvola del cassone (5% CO2/95% O2) e controllare il livello dell'acqua nell'impianto.
- Mettere la carta da filtro nella camera di registrazione dell'interfaccia per drenare il mezzo in eccesso e la carta per la pulizia dell'obiettivo sotto la montatura per fornire il mezzo alla fetta.
- Accendere il termoregolatore, gli amplificatori e il micromanipolatore.
- Lasciare che la temperatura nella camera di interfaccia si stabilizzi a 37 °C prima di iniziare le registrazioni.
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM glucosio, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 con pH 7,4) e utilizzarlo per riempire l'elettrodo di vetro con una siringa. Posizionarlo nell'elettrodo ricevente.
- Registrazioni di attività spontanee
- Una volta che la temperatura è stabile, rimuovere la piastra dall'incubatrice e tagliare una fetta dall'inserto con una lama molto affilata. Metterlo in un piatto da 60 mm con una goccia di terreno. Portalo alla camera di registrazione dell'interfaccia.
- Posiziona la fetta nella camera di interfaccia con l'ippocampo in basso a destra. Posizionare l'elettrodo ricevente nello strato di celle piramidali CA3.
- Procedere al protocollo di acquisizione continua e registrare per 30 min.
