Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle fette di corteccia rinale-ippocampo
NOTA: La preparazione delle fette di corteccia rinale-ippocampo utilizza ratti P6-7 Sprague-Dawley.
- Impostazione della coltura e preparazione del terreno
- Il giorno prima della coltura, preparare il terreno necessario e posizionarlo a 4 °C.
- Preparare il terreno di dissezione: 25 mM di glucosio nella soluzione salina bilanciata (GBSS) di Gey.
- Preparare il terreno di coltura: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% siero di cavallo (HS), 25 mM di glucosio, 30 μg/mL di gentamicina.
- Preparare il terreno di mantenimento: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM di L-glutammina, 30 μg/mL di gentamicina, HS (15%, 10%, 5% e 0%).
- Raccolta di cervelli
- Poco prima di iniziare la coltura, aggiungere 1,1 mL di terreno di coltura a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti con una pipetta P1000 e posizionarla a 37 °C.
- Posizionare tutta l'attrezzatura (microscopio di dissezione, tritatessuti, lampada da dissezione, strumenti di dissezione, elettrodi, piastre, inserti e carta da filtro) all'interno della cabina di sicurezza biologica e sterilizzare sotto la luce UV per 15 minuti.
- Regolare lo spessore della fetta a 350 μm.
- Estrarre il GBSS dal frigorifero. Aggiungere 5 ml di GBSS a sei piastre di Petri. Saranno necessarie sei piastre di Petri per animale.
- Sopprimere il cucciolo di ratto. Esegui la decapitazione usando una forbice affilata alla base del tronco encefalico dell'animale.
- Lavare la testa dell'animale tre volte in GBSS freddo e portarla all'interno dell'armadio di sicurezza.
- Isolamento tissutale e preparazione delle fette
- Inserire saldamente una pinza affilata nelle orbite dell'occhio per tenere la testa.
- Con una forbice sottile, tagliare la pelle/cuoio capelluto lungo la linea mediana partendo dal forame vertebrale verso i lobi frontali e metterla da parte.
- Tagliare allo stesso modo il cranio e lungo la fessura trasversale cerebrale (spazio tra cervello e cervelletto). Con una pinza lunga curva, allontanarla.
- Scartare i bulbi olfattivi con una spatola. Rimuovi il cervello dalla testa e mettilo in GBSS ghiacciato con la superficie dorsale rivolta verso l'alto (Figura 1A).
- Inserire la pinza sottile nel cervelletto e percorrere la linea mediana con la spatola aprendo ogni emisfero con molta attenzione (Figura 1B).
- Con una pinza a curva corta, rimuovere con cura il tessuto in eccesso che copre l'ippocampo, senza toccare la struttura dell'ippocampo. Quindi, con una spatola, tagliare sotto ogni ippocampo (Figura 1C).
- Prendi un emisfero e posizionalo, con l'ippocampo rivolto verso l'alto, su una carta da filtro. Ripetere la procedura con l'altra semisfera e posizionarla parallelamente al primo, nella carta da filtro. Mettere la carta da filtro sul tritatutto, con gli emisferi perpendicolari alla lama, e tagliare gli emisferi a fette da 350 μm (Figura 1D).
- Mettere il fazzoletto affettato in una capsula di Petri con GBSS freddo (Figura 1E).
- Separare accuratamente le fette utilizzando gli elettrodi a punta tonda (Figura 1F). Conservare solo le fette con corteccia renale e ippocampo strutturalmente intatti. Le aree DG e CA dovrebbero essere perfettamente definite, così come la corteccia entorinale e peririnale (Figura 1G).
- Posizionare ogni fetta sull'inserto (Figura 1H-I), con una spatola e un elettrodo a punta tonda. Rimuovere il mezzo di dissezione in eccesso attorno a ciascuna fetta con una pipetta P20 (Figura 1J). Quattro fette di corteccia rinale-ippocampo possono essere coltivate in un unico inserto (Figura 1K).
- Manutenzione della coltura
- Cambia il mezzo a giorni alterni.
- Riscaldare il fluido a 37 °C.
- Prendi i piatti dall'incubatrice. Raccogliere ciascun inserto tenendo il bordo di plastica con una pinza (Figura 1L).
- Utilizzare una mano libera per aspirare il terreno dal pozzo. Riposizionare l'inserto nel pozzetto e aggiungere 1 mL, con una pipetta P1000, di terreno fresco riscaldato (Figura 1M). Ripetere l'operazione per tutti gli inserti. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate tra la membrana e il fluido.
nota: Le fette di tipo epilettico subiscono una graduale e controllata privazione di siero nel terreno. A partire da 9 giorni in vitro, le fette vengono mantenute in NBA senza HS.
2. Saggio di assorbimento PI
NOTA: La morte cellulare è stata valutata monitorando l'assorbimento cellulare del colorante fluorescente ioduro di propidio (PI). Il PI è un composto polare, che entra nelle cellule con membrane cellulari danneggiate e interagisce con il DNA emettendo fluorescenza rossa (assorbanza 493 nm, emissione 630 nm). Poiché il PI non è destinato alle cellule vive, viene utilizzato per rilevare le cellule morte in una popolazione.
- Incubazione PI
- Preparare, in terreno di coltura, una nuova diluizione 1:10 del brodo PI.
- Per il test di captazione PI, rimuovere la piastra dall'incubatore e sollevare con cautela l'inserto. Aggiungere 13 μL di PI al terreno, con una pipetta P20, ottenendo una concentrazione finale di 2 μM. Agitare lentamente la piastra prima di riposizionare l'inserto. Assicurati che non ci siano bolle sotto le fette.
- Rimettere le fette nell'incubatore a 37 °C per 2 ore.
- Procedere con il protocollo di immunoistochimica, come descritto nella sezione successiva. Coprire le piastre con alluminio, poiché il PI è sensibile alla luce.
3. Immunoistochimica
NOTA: In immunoistochimica, un anticorpo neurone-specifico, così come anticorpi in grado di discriminare i fenotipi a riposo e reattivi di microglia e astrociti, sono stati utilizzati per valutare l'entità della morte neuronale e della gliosi in fette organotipiche epilettiche di corteccia rinale-ippocampo.
- Fissazione tissutale
- Rimuovere la piastra dall'incubatrice e aspirare il terreno. Fissare le fette con paraformaldeide (PFA) al 4% per 1 ora a RT, aggiungendo 1 mL di PFA sotto e sopra le fette, con una pipetta P1000.
- Rimuovere il PFA e aggiungere 1 ml di PBS. Inoltre, aggiungi PBS sotto e sopra le fette.
- Conservare le fette a 4 °C, in PBS, fino a nuovo utilizzo. Metti sempre il parafilm intorno alle piastre per evitare che si secchino.
- Fasi di immunocolorazione
- Lavare due volte, 10 minuti ogni volta, con 1 ml di PBS.
- Preparare una soluzione di permeabilizzazione/blocco contenente l'1% di Triton-X100, il 10% di HS e il 10% di BSA in PBS. Preparare una soluzione BSA al 5%.
- Disegna due rettangoli con la penna idrofobica (Figura 2A). Tagliare le fette dall'inserto (Figura 2B) con una lama molto affilata. Mettere due fette per vetrino (Figura 2C) e aggiungere 140 μl di soluzione di permeabilizzazione/bloccante sulla parte superiore di ciascuna fetta, utilizzando una pipetta P200. Incubare per 3 ore a RT.
- Diluire gli anticorpi primari alla diluizione di lavoro in BSA al 5% in PBS. Incubare con gli anticorpi primari per una notte a 4 °C.
- Incubare con gli anticorpi secondari per 4 ore a RT. Da questo punto in poi, proteggere la lastra dalla luce poiché si lavora con i fluorofori.
- Mettere una goccia da 50 μl di soluzione di Hoechst sulla parte superiore di ogni fetta e incubare per 20 minuti a RT.
- Lavare tra un'incubazione e l'altra. Lavare sempre tre volte, per 10 minuti ogni volta, con PBS-T.
- Rimuovere Hoechst e lavare come consigliato.
- Aggiungere 50 μl di terreno di montaggio sulla parte superiore di ogni fetta. Coprire con un vetrino coprioggetti e circondare con smalto per unghie (Figura 2D).
- Lasciare asciugare a RT per 24 h.
- Visualizzare l'immunocolorazione al microscopio confocale. Conservare le fette macchiate a -20 °C.
