Saggio di aggregazione PolyQ per identificare l'effetto neuroprotettivo di un composto nei vermi

Abstract

Fonte: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans come sistema modello per la scoperta di composti bioattivi contro la neurotossicità mediata da poliglutammina. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video descrive un metodo in vivo per esaminare il potenziale protettivo dei composti di test neuroprotettivi nel ridurre l'aggregazione polyQ nelle cellule muscolari della parete corporea dei nematodi e migliorare la proteotossicità associata all'aggregazione.

Protocollo

1. Saggio di aggregazione PolyQ

1. Preparazione di nematodi per il saggio di aggregazione polyQ
   1. Trasferire 300-500 larve L1 sincronizzate di AM141 in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con 500 μL di terreno S contenente OP50 (OD₅₇₀ di 0,7-0,8) e 5 mg/mL di astragalan, tipicamente un pozzetto per trattamento per un punto temporale.
   2. Sigillare la piastra con parafilm e incubare a 20 °C e 120 giri/min per 24, 48, 72 e 96 ore.
   3. Raccogliere i nematodi in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 ml e lavare con tampone M9 >3 volte mediante centrifugazione (1000 × g per 1 minuto) per rimuovere l'OP50 rimanente. Risospendere i nematodi AM141 nel buffer M9 e tenerli pronti per l'acquisizione dell'immagine.
2. Acquisizione di immagini fluorescenti e analisi dei dati
   NOTA: I dati vengono analizzati automaticamente con questo sistema di imaging ad alto contenuto. Se non è disponibile un dispositivo di imaging automatizzato, è possibile utilizzare un metodo convenzionale per preparare un tampone di agarosio per l'acquisizione delle immagini per ottenere prestazioni simili utilizzando un comune microscopio a fluorescenza.
   1. Trasferire 10-15 nematodi in ciascun pozzetto in una piastra da 384 pozzetti (volume finale 80 μl per pozzetto). Impostare 10 pozzetti di replica per ogni trattamento.
   2. Aggiungere 10 μL di 200 mM di azoturo di sodio a ciascun pozzetto per paralizzare i nematodi e lasciarli depositare sul fondo (5-10 min).
   3. Posizionare la lastra in un sistema di imaging ad alto contenuto per acquisire immagini fluorescenti (vedere la Tabella dei materiali per informazioni sul dispositivo e sul software).
   4. Aprire il software di acquisizione immagini e impostare i seguenti parametri.
      1. Aprire la finestra Configurazione acquisizione lastre e creare un nuovo set di esperimenti e un nuovo nome.
      2. Selezionare Ingrandimento come 2x, Binning della fotocamera come 1 e Tipo di piastra come piastra a 384 pozzetti.
      3. Impostare i pozzi e i siti (sito singolo) da visitare.
      4. Selezionare il filtro FITC (fluoresceina isotiocianato) e abilitare le opzioni di messa a fuoco basate su immagini.
      5. Impostare l'esposizione su 300 ms.
         nota: Le impostazioni di cui sopra possono essere testate e regolate per ottimizzare i parametri di imaging.
      6. Salva le impostazioni di acquisizione dell'immagine e fai clic sul pulsante Acquisisci lastra per eseguire.
   5. Analizza i dati dell'immagine utilizzando il software di analisi delle immagini.
      1. Aprire la finestra Rivedi dati piastra e selezionare la piastra di prova per l'analisi delle immagini.
      2. Fare doppio clic su un pozzetto di test per visualizzarne l'immagine.
      3. Seleziona Conta nuclei come metodo di analisi e fai clic sul pulsante Configura impostazioni per visualizzare una finestra per le seguenti impostazioni.
      4. Definire l'immagine sorgente dal canale FITC e selezionare l'algoritmo standard.
      5. Impostare i parametri di analisi dell'immagine come segue: larghezza minima approssimativa = 10 μm (= 2 pixel); larghezza massima approssimativa = 50 μm (= 12 pixel); intensità sopra lo sfondo locale = 1.000-2.000 livelli di grigio.
      6. Testare le impostazioni correnti per ottimizzare il metodo di analisi.
      7. Salva le impostazioni ed esegui l'analisi su tutti i wells.
         nota: Sono necessari ~20 minuti per completare l'analisi di una piastra a 384 pozzetti.
      8. Esporta i nuclei totali come numero totale di aggregati Q40::YFP in ciascun pozzo.
   6. Conta il numero di nematodi in ogni pozzetto.
   7. Calcolare il numero medio di aggregati Q40::YFP per nematode in ciascun gruppo e applicare un adattamento della curva non lineare ai dati di ciascun punto temporale.
   8. Calcola l'indice di inibizione:
      Indice di inibizione = (N_controllo - N_campione) / Ncontrol
      Dove N_controllo e N_campione sono il numero medio di aggregati Q40::YFP rispettivamente nel gruppo di controllo e in quello di trattamento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ceppo di C. elegans
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
Ceppo di E. coli
OP50	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagente
Aziduro di sodio	Fornitore verificato - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
attrezzatura
piastra per coltura cellulare a 384 pozzetti	Nest Biotechnology Co., Ltd.	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
piastra per coltura cellulare a 48 pozzetti	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=it&product_id=85
Microscopio a fluorescenza	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
Sistema di imaging ad alto contenuto	Dispositivi molecolari	ImageXpress	https://www.moleculardevices.com/ prodotti/sistemidi-imaging-cellulare#Imaging ad alto contenuto
Microcentrifuga	GeneCompany	VELOCITÀ GENETICA X1	https://www.genecompany.com/ index.php/Home/Merci/ goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Fotocamera digitale per microscopio	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
software
Software di acquisizione e analisi delle immagini	Dispositivi molecolari	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/ prodotti/sistemi-di-imaging-cellulare/ software-di-acquisizione-e-analisi/ metaxpress