Un test per studiare l'effetto del composto di prova contro la neurotossicità mediata da PolyQ nei vermi

Abstract

Fonte: Wang, Q. et al., Caenorhabditis elegans come sistema modello per la scoperta di composti bioattivi contro la neurotossicità mediata dalla poliglutammina. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, descriviamo un metodo per valutare l'effetto neuroprotettivo di un composto in esame, l'astragalano, sulla sopravvivenza neuronale in Caenorhabditis elegans dalla neurotossicità mediata da polyQ. Il test utilizza Caenorhabditis elegans che esprime le ripetizioni polyQ anormalmente espanse fuse a GFP nei loro neuroni ASH per misurare la sopravvivenza neuronale dopo il trattamento con il composto in esame.

Protocollo

1. Saggio di neurotossicità mediata da PolyQ

1. Trattamento di C. elegans con campioni di prova
   1. Per preparare i nematodi per il test di neurotossicità polyQ, trasferire 300-500 larve L1 sincronizzate di HA759 in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con 500 μL di terreno S contenente OP50 (OD₅₇₀ di 0,7-0,8) e 5 mg/mL di astragalan; tipicamente tre pozzetti replicati per ogni trattamento.
   2. Sigillare la piastra con parafilm e incubare a 15 °C e 120 giri/min per 3 giorni.
   3. Raccogliere i nematodi mediante centrifugazione e lavare 3-5 volte con tampone M9. Risospendere i nematodi nel tampone M9 per l'uso nei saggi di sopravvivenza neuronale e di evitamento.
2. Preparazione del tampone di agarosio
   1. Aggiungere 2 g di agarosio a 100 ml di tampone M9 (2%, p/v) e riscaldare la soluzione di agarosio in un forno a microonde fino quasi all'ebollizione.
   2. Erogare 0,5 mL di agarosio fuso al centro di un vetrino per microscopia di 1 mm di spessore posizionato tra due pezzi di lastre di vetro di 2 mm di spessore. Coprire con un altro vetrino in verticale. Una volta che l'agarosio si è raffreddato e solidificato, rimuovere delicatamente il vetrino superiore.
3. Saggio di sopravvivenza neuronale ASH
   1. Aggiungere una goccia di 20 mM di azoturo di sodio sul tampone di agarosio. Trasferisci 15-20 nematodi HA759 nella goccia per immobilizzarli.
   2. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sui nematodi. Tenere il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera digitale. Seleziona una lente dell'obiettivo 40x e un filtro FITC per rilevare i neuroni ASH positivi alla GFP nella regione della testa dei nematodi.
   3. Seleziona più di 50 nematodi in ciascun gruppo in modo casuale per contare il numero di nematodi con neuroni ASH bilaterali marcati con GFP nella loro regione della testa. Calcola il tasso di sopravvivenza dei neuroni ASH:
      Sopravvivenza neuronale (%) =
      Dove N_{sopravvivenza} e N_totale sono rispettivamente il numero di nematodi con neuroni ASH GFP-positivi e il numero totale di nematodi testati in ciascun gruppo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ceppo di C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Ceppo di E. coli
OP50	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagente
agarosio	Bioovest	Codice 111860
Aziduro di sodio	Fornitore verificato - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
attrezzatura
piastra per coltura cellulare a 48 pozzetti	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Microscopio a fluorescenza	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/article/442.html
Sistema di imaging ad alto contenuto	Dispositivi molecolari	ImageXpress Pico	https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
Microcentrifuga	GeneCompany	VELOCITÀ GENETICA X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Fotocamera digitale per microscopio	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
microonde	Midea Corp.	M1-211A	https://www.midea.cn/10000/10000000001
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
software
Software di acquisizione e analisi delle immagini	Dispositivi molecolari	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/ prodotti/sistemi-di-imaging-cellulare/ software-di-acquisizione-e-analisi/ metaxpress