Esaminare il comportamento di chemioevitazione nei vermi transgenici utilizzando il saggio di evitamento osmotico

Abstract

Fonte: Wang, Q. et al., Z. Caenorhabditis elegans come sistema modello per la scoperta di composti bioattivi contro la neurotossicità mediata da poliglutammina. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive un test di evitamento osmotico per esaminare il comportamento di chemioevitamento in un modello di verme transgenico. Il comportamento di evitamento viene testato in una piastra in presenza di una barriera ad alta osmotiche e di un chemioattrattivo. I vermi con una perdita funzionale di neuroni vengono attratti dal chemioattrattivo, attraversano la barriera ad alta osmotizzazione e si paralizzano nella zona della trappola a causa della soluzione anestetica.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

NOTA: Vedi la Tabella 1 per le ricette delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Preparazione dei materiali per il saggio di Caenorhabditis elegans

1. Mantenimento dei ceppi di C. elegans
   1. Procurarsi i ceppi di C. elegans (AM141 e HA759) ed Escherichia coli (OP50 e NA22) (vedere la Tabella dei materiali).
   2. Mantenere i nematodi sulla piastra del terreno di crescita dei nematodi (NGM) seminata con E. coli OP50 a 20 °C per AM141 o a 15 °C per HA759.
2. Preparazione della coltura batterica di E. coli OP50
   1. Prelevare una singola colonia di E. coli OP50 da una piastra di striature Luria-Bertani (LB) e inocularla in 50 ml di coltura LB liquida.
   2. Incubare i batteri OP50 in un agitatore a 37 °C e 200 giri/min fino a raggiungere una densità ottica di ~0,5 a 570 nm (OD₅₇₀).
   3. Conservare la coltura batterica OP50 a 4 °C e utilizzarla entro due settimane.
3. Preparazione di piastre NGM con batteri OP50
   1. Aggiungere 20 g di agar, 2,5 g di peptone, 3,0 g di NaCl e 975 ml di acqua deionizzata in un flacone autoclavabile da 1 litro. Autoclavare a 121 °C per 30 min.
   2. Posizionare il flacone di agar NGM liquido sul banco a raffreddare a ~60 °C, quindi aggiungere le seguenti soluzioni madre sterili: 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di 1 M MgSO₄, 1 mL di 5 mg/mL di colesterolo e 25 mL di 1 M di fosfato di potassio (pH 6,0).
   3. Versare 20 ml di NGM in una piastra di Petri sterile da 90 mm e lasciare raffreddare e solidificare le piastre sul banco. Tenere i piatti capovolti e lasciarli asciugare sul banco a temperatura ambiente per 2 giorni.
   4. Erogare 200 μl di coltura batterica OP50 su ciascuna piastra NGM e distribuire uniformemente con un'asta di rivestimento in vetro sterile. Chiudere i coperchi e incubare le piastre per una notte a 37 °C.
   5. Conservare le piastre NGM seminate con OP50 in una scatola di plastica con coperchio a temperatura ambiente e utilizzarle entro due settimane.
4. Preparazione della popolazione di C. elegans sincronizzata per età
   1. Raccogliere i nematodi adulti gravidi in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 1000 × g per 1 minuto. Lavare tre volte e risospendere i nematodi in tampone M9.
   2. Aggiungere un volume uguale di soluzione di candeggina e agitare delicatamente per 3-5 minuti. Monitorare lo sbiancamento ogni 15 s al microscopio da dissezione.
      nota: La soluzione di candeggina deve essere preparata fresca prima dell'uso mescolando volumi uguali di NaOCl al 10% e NaOH 1 M (Tabella 1).
   3. Una volta che la maggior parte dei nematodi si è rotta, fermare la digestione diluendo con un tampone M9. Centrifugare rapidamente per rimuovere il surnatante e risospendere il pellet nel tampone M9 per ripetere il lavaggio tre volte.
   4. Risospendere il pellet nel mezzo S. Lasciare che i residui di nematodi si depositino per gravità per 2-3 minuti mentre le uova rimangono nel surnatante.
   5. Aspirare il surnatante in una nuova provetta sterile per microcentrifuga. Raccogliere le uova per centrifugazione a 1000 × g per 1 min.
   6. Scartare ~80% del surnatante e trasferire le uova in un pallone sterile contenente 20 ml di terreno S. Mettere il pallone in uno shaker e incubare le uova per una notte senza cibo a 120 giri/min per ottenere nematodi L1 sincronizzati.

2. Saggi di neurotossicità mediati da PolyQ

1. Trattamento di C. elegans con campioni di prova
   1. Per preparare i nematodi per il test di neurotossicità polyQ, trasferire 300-500 larve L1 sincronizzate di HA759 in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con 500 μL di terreno S contenente OP50 (OD570 di 0,7-0,8) e 5 mg/mL di astragalan, tipicamente tre pozzetti replicati per ogni trattamento.
   2. Sigillare la piastra con parafilm e incubare a 15 °C e 120 giri/min per 3 giorni.
   3. Raccogliere i nematodi mediante centrifugazione e lavare 3-5 volte con tampone M9. Risospendere i nematodi in tampone M9 per l'uso in saggi di sopravvivenza neuronale e di evitamento.
2. Saggio di evitamento osmotico
   1. Dividere una piastra NGM senza alimenti (9 cm) in zone normali (N) e di trappola (T) con una linea di glicerolo 8 M (~30 μL) al centro. Stendere una linea di 200 mM di azoturo di sodio (~20 μL) a ~1 cm di distanza dalla linea del glicerolo per paralizzare i nematodi che attraversano la barriera del glicerolo nella Zona T.
   2. Trasferire ~200 nematodi ciascuno nella Zona N di tre piastre replicate per ogni gruppo. Aggiungere una goccia di butandione all'1% (~2 μL) sulla Zona T (1 cm dal bordo della piastra) per attirare i nematodi. Coprire immediatamente il coperchio della capsula di Petri e incubare a 23 °C per 90 minuti.
   3. Segna il numero di nematodi sulle zone N e T al microscopio. Calcola l'indice di elusione utilizzando eq.
      Indice di elusione = N / (T + N)
      Dove N e T sono il numero di nematodi nelle zone N e T, rispettivamente. I dati sono presentati come medie ± deviazione standard (SD) di tre repliche, rappresentative di >3 esperimenti indipendenti.
   4. Eseguire un test t a due code non accoppiato per confrontare i dati dell'astragalano e dei gruppi di controllo.

Tabella 1:

soluzione	Istruzioni per la preparazione	immagazzinamento
1 M CaCl2	111 g CaCl2	Conservare a temperatura ambiente (RT)
	Aggiungere dH2Ø a 1 L
	autoclave
1 M Fosfato di potassio (pH 6.0)	108,3 g KH2PO4	Memorizza su RT
	35,6 K2HPO4
	Aggiungere dH2Ø a 1 L
	autoclave
1 M MgSO4	246 g MgSO4·7H2O	Memorizza su RT
	Aggiungere dH2Ø a 1 L
	autoclave
Colesterolo in etanolo (5 mg/mL)	0,5 g Colesterolo	Conservare a -20 °C
	Aggiungere etanolo a 100 ml
	Non sterilizzare in autoclave!
1 M Citrato di potassio (pH 6.0)	Aggiungere 10,0 g di acido citrico monoidrato	Memorizza su RT
	Aggiungere 146,75 g di acido citrico tri-potassico monoidrato
	Aggiungere dH2Ø a 1 L
	autoclave
Soluzione di metalli in tracce	0,93 g EDTA disodico	Conserva al buio su RT
	0,345 g FeSO4·7H2O
	0,1 g MnCl2·4H2O
	0,145 g di ZnSO4·7H2O
	Aggiungere 0,0125 g di CuSO4·5H2O
	Aggiungere dH2O a 500 mL
	autoclave
1 M NaOH	4 g di NaOH	Memorizza su RT
	Aggiungere dH2O a 100 mL
Soluzione di candeggina	0,5 mL di NaOH 1 M	Prepara fresco prima dell'uso
	0,5 mL di NaOCl al 10%
M9 buffer	5 g di NaCl	Memorizza su RT
	3 g KH2PO4
	6 g Na2HPO4
	Aggiungere dH2Ø a 1 L
	autoclave
	Aggiungere 1 mL di 1 M MgSO4
S basale	5,85 g di NaCl	Memorizza su RT
	6,0 g KH2PO4
	1,0 g K2HPO4
	Aggiungere dH2O a 973 mL
	Autoclave e raffreddare a ~60 °C
	Aggiungere 1 mL di colesterolo 5 mg/mL in etanolo
S medio	S basale	Memorizza su RT
	Aggiungere 3 mL di CaCl1 M 2
	Aggiungere 3 mL di 1 M MgSO4
	Aggiungere 10 mL di citrato di potassio 1 M
	Aggiungere 10 mL di soluzione di metalli in tracce
	Tutti i componenti sono stati sterilizzati in autoclave, non in autoclave
5 mg/mL di astragalano	0,1 g di astragalano	Conservare in aliquote a -80 °C
	Aggiungere 20 mL di terreno S
	Filtrare attraverso il filtro a siringa da 0,22 μm
200 mM di azide di sodio	1,3 g di NaN3	Conservare a 4 °C
	Aggiungere 100 mL di terreno S
8 M Glicerolo	73,67 g di glicerolo	Memorizza su RT
	Aggiungere dH2O a 100 mL
10% di azioni di butanedione	Miscelare 10 μL di butandione con 90 μL di dH2O	Negozio presso RT
1% butandione	Aggiungere 10 μl di butandione a 90 μl di dH2O	Negozio presso RT
1 L della cultura Luria-Bertani (LB)	10 g di NaCl	Memorizza su RT
	10 g di Triptone
	5 g Estratto di lievito
	Aggiungere dH2Ø a 1 L
	autoclave

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ceppi di C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Ceppi di E. coli
NA22	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagente
agar	Fornitore verificato - Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
Butanedione	Fornitore verificato - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb 595d0
colesterolo	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
glicerolo	Aladdin Co., Ltd.	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
peptone	Fornitore verificato - Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd.	Codice 050170B	https://www.huankai.com/show/21074.html
Aziduro di sodio	Fornitore verificato - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
idrossido di sodio	Fornitore verificato - Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6
Soluzione di ipoclorito di sodio	Fabbrica di reagenti chimici di Guangzhou	7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
Triptone	Oxoid Ltd.	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Estratto di lievito	Oxoid Ltd.	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
attrezzatura
piastra per coltura cellulare a 48 pozzetti	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Piastra Petri da 90 mm	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
autoclave	Pananica	MLS-3781L-PC
Microscopio da dissezione	Fornitore verificato - ChongQing Optical Co., Ltd.	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Microcentrifuga	GeneCompany	VELOCITÀ GENETICA X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
scuotitore	Zhicheng Inc.	ZWY-2102C	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html