Saggio della ferita per valutare la capacità migratoria dei mioblasti murini in co-coltura

Abstract

Fonte: Toubat, O. et al., Modellazione della segnalazione Wnt non canonica paracrina in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive un test di guarigione delle ferite in co-coltura senza contatto per valutare la capacità migratoria dei mioblasti murini. Questo aiuta a comprendere i componenti di invio e ricezione del segnale delle interazioni di segnalazione Wnt non canoniche paracrine in vitro.

Protocollo

1. Saggio della ferita:

(La Figura 1 delinea il modello schematico del test)

1. Lasciare che gli inserti cellulari O9-1 e i pozzetti della camera cellulare C2C12 aderiscano e proliferino nell'incubatore fino a quando entrambe le cellule non raggiungono una confluenza del ~70-80% prima di procedere con questa parte del protocollo. Se le cellule crescono >90% confluenti, non procedere con il test scratch, poiché le cellule si staccheranno semplicemente dal pozzetto.
2. Scaldare 1x PBS e C2C12 medium mettendoli a bagnomaria a 37 °C.
3. Rimuovere il mezzo surnatante dal pozzetto della camera C2C12 e lavare le cellule una volta con 1x PBS. Rimuovere il PBS 1x e graffiare immediatamente le cellule con un puntale per pipetta P10 sterile.
   1. Passare saldamente il puntale della pipetta sterile P10 in un'unica direzione per coprire l'intera lunghezza o larghezza del monostrato cellulare (ad esempio, da destra a sinistra, dall'alto verso il basso). Assicurati di graffiare ogni pozzetto contenente le celle solo una volta.
      nota: Per ottimizzare i risultati del graffio, graffiare pozzetti di diverse condizioni sperimentali a un livello di confluenza simile. Per fare ciò, assicurarsi che ogni pozzetto a 4 camere abbia celle per ogni condizione sperimentale richiesta (ad esempio, pozzetto #1 controllo negativo, pozzetto #2 controllo positivo). Inoltre, utilizzare una nuova pipetta sterile P10 per ogni graffio e applicare ogni volta una quantità simile di forza alla pipetta. Non tentare di creare più di un graffio in ogni pozzetto.
   2. Dopo aver grattato, aggiungere rapidamente 1 mL di 1x PBS nel pozzetto utilizzando un puntale per pipetta P1000. Ripeti questo processo per ogni pozzetto che verrà graffiato.
      nota: Data la variabilità associata a ciascun graffio, si raccomanda di utilizzare più pozzetti (n = 3) per la creazione della ferita in ogni condizione sperimentale. Lavora rapidamente poiché è fondamentale ridurre al minimo la durata per la quale le celle sono senza 1x PBS durante questi passaggi. Dopo aver rimosso 1x PBS da ogni pozzetto, non si dovrebbero impiegare più di 5 secondi per generare una ferita in ogni pozzetto.
4. Dopo aver generato una ferita e aver aggiunto 1x PBS in ciascun pozzetto, visualizzare il graffio utilizzando un microscopio invertito a campo chiaro e utilizzare questa immagine come dimensione di base della ferita (tempo 0). Per scattare immagini, procedi come segue:
   1. Accendere il computer e il microscopio (vedere la Tabella dei materiali) premendo il pulsante di accensione. Posizionare il carrello della camera sul tavolino e ruotare la manopola dell'obiettivo su un ingrandimento 5x.
   2. Aprire il software di imaging (vedere la Tabella dei materiali) facendo doppio clic sull'icona del software sul desktop del computer. Fare clic sulla scheda Fotocamera nella schermata iniziale del software. Fare clic sul pulsante Live per visualizzare le celle nella scheda AxioCam IC.
   3. Assicurarsi che il filtro della luce sia estratto completamente per consentire alla luce di passare alla fotocamera e allo schermo del computer. Spostare e/o ruotare manualmente il vetrino della camera per posizionare l'area della ferita al centro dell'immagine dal vivo sulla scheda AxioCam IC.
   4. Per scattare immagini, fare clic su Scatta per aprire una nuova scheda accanto alla scheda AxioCam IC che contiene l'immagine.
   5. Per salvare l'immagine fissa, fare clic su File in alto a sinistra nella home page del software | Salva con nome | Immettere il nome del file nella casella del nome del file. Salvare la figura in formato immagine Carl Zeiss (*.czi) (impostazione predefinita) e selezionare desktop sulla barra a sinistra per salvare il file sul desktop come file .czi, che può essere aperto solo nel programma software Zen lite 2012.
   6. Per salvare l'immagine come .tiff, fare clic su File | Salva con nome | Immettere il nome del file nella casella Nome file. Salvare la figura come file immagine con tag (*.tiff) facendo clic sul pulsante Salva come tipo e selezionando *.tiff dal menu a discesa.
      nota: Il formato .tiff può essere aperto in qualsiasi software di elaborazione delle immagini.
   7. Riposizionare manualmente il vetrino della camera per scattare altre 2-3 immagini in altri punti della ferita nello stesso pozzetto.
      nota: In totale, ciò si tradurrà in 3-4 immagini non sovrapposte e ad alto ingrandimento della ferita in ciascun pozzetto.
5. Rimuovere 1x PBS da ciascun pozzetto e aggiungere 1 mL di terreno C2C12.
   nota: Prestare attenzione a non pipettare in modo troppo aggressivo quando si rimuovono o si aggiungono soluzioni al pozzetto della camera dopo la generazione della ferita, poiché ciò potrebbe causare il distacco delle cellule dal pozzetto della camera. Inoltre, inclinare bene la camera in modo che l'aspirazione e la reintroduzione delle soluzioni possano essere effettuate agli angoli di ciascun pozzetto per ridurre al minimo la rottura del monostrato cellulare.
6. Assemblare il sistema di cocoltura con inserti a pozzetti posizionando manualmente gli inserti contenenti le cellule O9-1 in ciascun pozzetto della camera. Spingere delicatamente gli inserti verso il basso nel pozzetto in modo che la parte inferiore dell'inserto si trovi appena sopra le cellule C2C12 sottostanti. Restituire i costrutti di inserimento del pozzetto all'incubatore.
   nota: Non permettere che la parte inferiore dell'inserto tocchi fisicamente e distrugga meccanicamente le cellule C2C12 sottostanti.
7. Lasciare migrare le cellule per un totale di 9-12 ore. Per determinare il tempo di migrazione ottimale, controllare le cellule a 6 ore dalla creazione della ferita, quindi ogni 2-3 ore successivamente. Termina l'esperimento quando le cellule in condizioni di controllo o di controllo positivo iniziano a coprire completamente la ferita><. nota: Data la natura senza contatto del costrutto, non è necessario rimuovere l'inserto sovrastante dai pozzetti durante il controllo della progressione della migrazione intervallare. La variabilità migratoria sarà osservata in base a fattori quali i tipi di cellule utilizzate in questo test, la densità cellulare al momento della generazione della ferita, la larghezza della ferita creata e le condizioni sperimentali delle cellule manipolate (ad esempio, knockdown genico, aggiunta di proteine ricombinanti). Le concentrazioni di questi reagenti devono essere determinate sperimentalmente con le indicazioni delle raccomandazioni del produttore.

Risultati

Figura 1: Modello schematico del saggio.La fase 1 include l'espansione in vitro dei mioblasti C2C12 e delle NCC utilizzando cellule feeder STO. La fase 2 prevede la placcatura delle NCC e delle cellule C2C12 nel sistema di cocoltura. La fase 3 include il test della ferita eseguito nelle cellule C2C12 sottostanti per valutare la capacità migratoria cellulare. La fase 4 prevede l'immunocoloraz...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linea cellulare di mioblasti murini C2C12	ATCC	Codice CRL-1772
Sistema di scorrimento a camera, 4 pozzetti	ThermoFisher Scientifico	154526
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), glicemia alta (4,5 g/L), Lglutammina (2 mM)	Corning	10-017-CV	Conservato a 4 °C
Puntali per pipette graduati e sterili, 10 μl	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1111-3810
Linea cellulare della cresta neurale O9-1	Millipore Sigma	SCC049
Soluzione salina fosfato tampone (PBS), 1x, senza calcio e magnesio, pH 7,4	Corning	21-040-CV	Conservato a 4 °C
Supporto permeabile Falcon per piastra a 24 pozzetti con membrana in PET trasparente da 0,4 μM	Corning	353095
Siero fetale bovino	Fisher Scientifico	W3381E	Conservato in aliquote da 50 mL a -20 °C
Microscopio ottico Zeiss invertito Axio Vert.A1	Carl Zeiss AG
Software di microscopia Zen lite 2012	Carl Zeiss AG		Software di imaging