Saggio di immunoassorbimento enzimatico per la verifica di coniugati anticorpo-antigene chimicamente accoppiati

Abstract

Fonte: Volckmar, J. et al., Coniugazione chimica di un anticorpo purificato diretto a DEC-205 con proteina a lunghezza intera per il targeting di cellule dendritiche di topo in vitro e in vivo. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra il rilevamento di complessi anticorpo-antigene coniugati chimicamente tramite il test di immunoassorbimento enzimatico a sandwich, o ELISA, tecnica. L'anticorpo catturato si lega all'epitopo specifico dell'antigene del coniugato anticorpo-antigene, che può essere successivamente visualizzato utilizzando un anticorpo secondario legato all'enzima.

Protocollo

1. Produzione di αDEC-205 dalla linea cellulare di ibridomi NLDC-145

1. Per la produzione di anticorpi, scongelare le cellule NLDC-145 crioconservate che producono αDEC-205 a 37 °C in un bagno d'acqua. Espandere le celle a 37 °C e 5% di CO₂. Saranno necessari due flaconi da 75 cm² per procedere alla produzione di anticorpi. Le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite in una cabina di sicurezza per garantire condizioni di lavoro sicure e prevenire la contaminazione delle colture.
   1. Risospendere 1 mL di cellule scongelate (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ cellule/mL) in 9 mL di terreno ISF-1 integrato con penicillina/streptomicina all'1% (preriscaldato a 37 °C) in un pallone di coltura cellulare (25 cm²). Porre il matraccio orizzontalmente in un incubatore per colture cellulari a 37 °C, 5% CO₂.
   2. Coltura delle cellule a 37 °C e 5% di CO₂, fino alla confluenza del 70%. Questo dovrebbe essere normalmente raggiunto dopo 24 - 48 ore.
   3. Una volta che le cellule sono confluenti al 70%, trasferire l'intera sospensione cellulare NLDC-145 (10 mL) in una provetta da centrifuga conica da 15 mL utilizzando un pipetta controller con una pipetta in un intervallo di volume compreso tra 1 e 10 mL. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 250 x g per 10 min a temperatura ambiente.
   4. Preriscaldare il terreno ISF-1 a 37 °C in un bagno d'acqua e risospendere il pellet in 12 mL di terreno ISF-1 integrato con penicillina/streptomicina all'1%. Trasferire la sospensione cellulare risospesa in un pallone per coltura cellulare fresco (75 cm²).
   5. Coltivare ed espandere le cellule in terreno ISF-1 integrato con penicillina/streptomicina all'1% a 37 °C e CO₂ al 5%, fino al 70% confluente e vitale al 99%. Questo dovrebbe essere normalmente raggiunto dopo 48 - 72 ore.
   6. Dividere le celle in due fiasche da 75 cm². A tale scopo, lavare prima il fondo del pallone di coltura cellulare/la superficie di coltura con la sospensione cellulare per rimuovere tutte le cellule NLDC-145 dalla superficie. Trasferire 6 mL di sospensione cellulare NLDC-145 in uno dei due flaconi freschi da 75 cm² e aggiungere un terreno ISF-1 preriscaldato integrato con penicillina/streptomicina all'1% fino a 12 mL.
      nota: Non rinnovare il terreno di coltura cellulare poiché le cellule NLDC-145 avranno condizionato il terreno. Trasferire le cellule insieme al loro terreno e riempire la coltura fino al volume desiderato con terreno fresco. Questo è fondamentale per la vitalità e la massima produzione di anticorpi da parte delle cellule NLDC-145.
   7. Espandere le colture cellulari a 37 °C e 5% di CO₂, fino a circa il 70% confluente, che generalmente si ottiene dopo 48 - 72 ore.
   8. Una volta che le cellule sono confluenti al 70%, trasferire 10 mL della sospensione cellulare NLDC-145 espansa da ciascuno dei flaconi da 75 cm² in un flacone a rullo in PETG (polietilene tereftalato glicole) (1.050 cm²). A tal fine, lavare il fondo del pallone di coltura cellulare/la superficie di coltura con la sospensione cellulare per rimuovere tutte le cellule dalla superficie utilizzando un controller per pipette e una pipetta da 10 ml.
   9. Aggiungere 140 mL di terreno ISF-1 integrato con penicillina/streptomicina all'1% (preriscaldato a 37 °C) direttamente dal flacone del terreno a ciascuno dei flaconi a rullo contenenti NLDC-145, riempiendoli fino a 150 mL.
      nota: Vedere la nota al punto 1.1.6.
   10. Fermentare le bottiglie a rulli a 37 °C, 5% CO₂ e 25 giri/min per tre giorni.
   11. Aggiungere 150 mL di terreno ISF-1 integrato con penicillina/streptomicina all'1% (preriscaldato a 37 °C) a ciascuno dei flaconi a rullo contenenti NLDC-145, riempiendoli fino a 300 mL.
   12. Colture per altri tre giorni, le bottiglie a rullo che ora contengono 300 mL di coltura a 37 °C, 5% di CO₂ e 25 giri/min.
   13. Aggiungere altri 100 mL di terreno ISF-1 integrato con penicillina/streptomicina all'1% (preriscaldato a 37 °C) a ciascuno dei flaconi a rullo contenenti NLDC-145, riempiendoli così fino a 400 mL.
   14. Colture i flaconi a rullo che ora contengono 400 mL di coltura ciascuno a 37 °C, 5% di CO₂ e 25 giri/min per altri sette giorni.
       nota: Durante questa settimana, la coltura diventa molto densa (fino al 95% di densità) e la vitalità diminuisce (fino a un minimo del 50%), consentendo il massimo rilascio di anticorpi.
2. Per la purificazione di αDEC-205 dal surnatante di coltura, versare la sospensione cellulare NLDC-145 (da entrambi i flaconi a rullo) direttamente in flaconi da centrifugazione autoclavati da 500 mL.
   nota: Deve essere raccolto un volume totale di 800 mL di coltura.
   1. Centrifugare la coltura per 30 minuti a 8.600 x g e 4 °C per rimuovere cellule e detriti.
   2. Raccogliere i surnatanti, scartando i pellet e raccogliendo i surnatanti in un flacone di reagenti sterile.
      nota: La purificazione di αDEC-205 può essere iniziata immediatamente (fase 2) oppure il surnatante può essere conservato a breve termine a 4 °C.

2. Purificazione dell'anticorpo αDEC-205 dal surnatante cellulare NLDC-145

NOTA: Dal surnatante cellulare NLDC-145, αDEC-205 viene purificato utilizzando una colonna di proteina G Sepharose (riutilizzabile). Le dimensioni della colonna sono 15 mm x 74 mm e 5 mL di proteina G Sepharose sono confezionati per colonna.

1. Per la preparazione e il lavaggio della colonna di proteina G Sefarosio, mettere un tappo di gomma ermetico sull'apertura superiore della colonna di proteina G Sepharosio. Forare il tappo di gomma con due cannule sterili (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
   1. Collegare una siringa da 10 ml a una delle due cannule e un tubo flessibile in silicone (circa 100 cm di lunghezza, 2,5 - 3 mm di diametro) con un connettore per tubi alla seconda cannula.
      nota: La struttura siringa/tappo di gomma è riutilizzabile e fornisce un vuoto che si traduce in un flusso continuo del grande volume di surnatante di coltura alla colonna di proteina G Sefarosio. A tal fine, tirare leggermente indietro lo stantuffo della siringa per garantire un flusso continuo del fluido nei passaggi successivi.
   2. Lavare la colonna con 50 mL di acido acetico glaciale 0,1 M (pH 2) per rimuovere gli anticorpi potenzialmente rimanenti da qualsiasi precedente purificazione degli anticorpi. Mettere l'estremità del tubo di silicone nel flacone di reagente riempito di acido acetico glaciale (pH 2) da 0,1 M. Come risultato del vuoto indotto, 50 mL dell'acido acetico glaciale 0,1 M (pH 2) attraversano goccia a goccia la colonna di proteina G Sepharose.
      NOTA: L'acido acetico glaciale 0,1 M (pH 2) deve essere conservato in un flacone di reagente o appena riempito in un becher.
   3. Lavare la colonna con 100-200 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Inserire l'estremità della provetta in silicone in un flacone o becher di reagenti riempito di PBS. Lasciare che 100-200 mL di PBS scorrano goccia a goccia attraverso la colonna proteica G Sefarosio.
2. Per la purificazione degli anticorpi dal surnatante NLDC-145, caricare 800 mL del surnatante NLDC-145 (ottenuto dal passaggio 1.2.2.) sulla colonna. Inserire l'estremità del tubo di silicone nel flacone di reagente riempito di surnatante NLDC-145. Far scorrere 800 mL di surnatante NLDC-145 goccia a goccia attraverso la colonna.
   1. Lavare la colonna con 500 mL di PBS. Mettere l'estremità della provetta di silicone in un flacone di reagente o in un becher riempito di PBS. Far scorrere 500 mL di PBS goccia a goccia attraverso la colonna.
   2. Per l'eluizione, utilizzare 20 provette da 1,5 mL e pipettare 100 μl di Tris-HCl da 1,5 M (pH 8,8) in ciascuna provetta da 1,5 mL. Rimuovere il tappo di gomma dalla colonna e pipettare 1 mL di glicina 0,1 M (pH 3) nella camera superiore della colonna di proteina G Sefarosio per eluire l'anticorpo dalla colonna. Raccogliere il flusso direttamente sotto forma di eluato in una delle provette da 1,5 mL preparate.
   3. Ripetere la fase di eluizione (2.2.2.) per tutte le 20 provette (1,5 mL).
   4. Determinare la densità ottica di tutte le frazioni di eluizione a 280 nm (OD₂₈₀) utilizzando uno spettrofotometro per identificare le frazioni contenenti anticorpi.
      nota: Utilizzare la prima frazione di eluizione come bianco.
   5. Raggruppare tutte le frazioni con un OD₂₈₀ maggiore di 0,5 (circa 10 frazioni).
   6. Conservare la colonna proteica G Sepharose riempita con etanolo al 20% a 4 °C.
3. Dializzare le eluizioni raggruppate contro 1000 mL di PBS (in un becher da 2000 mL) a 4 °C durante la notte utilizzando un tubo per dialisi con un cut-off del peso molecolare (MWCO) di 12 - 14 kDa.
   1. Tagliare il tubo per dialisi in pezzi di 20 cm. Far bollire il tubo per dialisi in 500-800 mL di 10 mM EDTA (pH 7,5) per 30 minuti in un becher utilizzando una piastra calda per rimuovere la contaminazione. Scartare la soluzione 10 mM di EDTA (pH 7,5) e far bollire il tubo di dialisi in acqua deionizzata per 10 min.
      nota: Il tubo per dialisi può essere utilizzato direttamente o conservato in una soluzione di sodio azide allo 0,01% (NaN₃)/H₂O a 4 °C fino al successivo utilizzo.
   2. Chiudere il fondo del tubo per dialisi con un apposito dispositivo di chiusura/morsetto incernierato in un unico pezzo e pipettare con cura l'eluizione degli anticorpi nel tubo per dialisi. Chiudere la parte superiore del tubo di dialisi con un secondo morsetto.
   3. Fissare il morsetto superiore del tubo per dialisi a un supporto galleggiante, inserirlo insieme a un'ancoretta magnetica nel becher riempito di PBS e posizionare il becher su un agitatore magnetico.
   4. Dializzare per una notte mescolando a 4 °C.
4. Per aumentare la concentrazione di αDEC-205, caricare l'intero dialisato su un concentratore centrifugo con MWCO da 10 kDa. Aprire una pinza del tubo e pipettare con cura l'intero dialisato dal tubo di dialisi nel concentratore centrifugo (10 kDa MWCO).
   nota: Non toccare il fondo del concentratore con la punta della pipetta.
   1. Centrifugare per 30 minuti a 693 x g (2.000 giri/min) e 4 °C.
   2. Caricare il concentratore centrifugo con 10 mL di PBS e centrifugare a 693 x g (2.000 giri/min) e 4 °C fino a quando il volume finale di soluzione anticorpale rimasto è 1-1,5 mL.
      nota: Se necessario, ripetere la fase di centrifugazione del punto 2.4.1. per regolare la quantità desiderata.
   3. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la densità ottica della soluzione concentrata di αDEC-205 a 280 nm (OD₂₈₀). Usa PBS come vuoto.
   4. Calcolare la concentrazione di αDEC-205 utilizzando la seguente formula:
      concentrazione [mg/mL] = OD₂₈₀/1,4.
   5. Filtrare la soluzione αDEC-205 utilizzando un'unità filtro a siringa da 0,22 μm.
      nota: La purificazione di αDEC-205 dal surnatante cellulare di ibridoma NLDC-145 può essere ottenuta anche mediante FPLC (cromatografia liquida veloce delle proteine). αDEC-205 purificato può essere conservato a 4 °C o a -18 °C per una conservazione a lungo termine.

3. Coniugazione chimica di OVA a αDEC-205

NOTA: Per una coniugazione chimica ottimale è necessario un rapporto di 0,5 mg di proteina OVA e 2,5 mg di αDEC-205 (1:5). Tuttavia, questo rapporto può variare per altre proteine e anticorpi e deve essere ottimizzato per coniugati alternativi. La riduzione dei legami disolfuro della proteina OVA viene eseguita attraverso l'incubazione con 30 mM di TCEP-HCl, che espone i gruppi sulfidrilici per la coniugazione chimica a αDEC-205 e 240 μl di TCEP-HCl sono necessari nel passaggio 3.2. Entrambe le fasi, la riduzione dell'OVA indotta da TCEP (fase 3.1) e l'attivazione sulfo-SMCC di αDEC-205 (fase 3.2.) devono essere preferibilmente eseguite in parallelo.

1. Preparare una soluzione di TCEP-HCl da 125 mM (pH 7,0). Pesare la quantità desiderata di TCEP-HCl e sciogliere il TCEP-HCl in Tris base 0,9 M (pH 8,8). Utilizzare strisce indicatrici di pH per testare il pH della soluzione TCEP-HCl da 125 mM (che dovrebbe essere neutro) e regolare il pH con la base Tris (pH 8,8).
   1. Pipettare 200 μL di soluzione proteica OVA (contenente 0,5 mg di OVA) in una provetta sterile da 1,5 mL. Aggiungere 240 μl, 125 mM di TCEP-HCl e 560 μl di acqua ultrapura sterile alla proteina OVA utilizzando una pipetta fino a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL di proteina OVA e 30 mM di TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      NOTA: 2,5 mg di EndoGrade OVA (liofilizzato) vengono disciolti in 1 mL di PBS dando luogo a una soluzione OVA da 2,5 mg/mL.
   2. Incubare gli OVA/TCEP-HCl risultanti a temperatura ambiente per 1,5 h.
      nota: Non prolungare questa fase di incubazione.
2. Per attivare αDEC-205 per la coniugazione, sciogliere 2 mg di sulfo-SMCC in 100 μL di acqua ultrapura.
   nota: Il sulfo-SMCC è suscettibile all'idrolisi. Pertanto, devono essere maneggiate rapidamente quantità maggiori di solfo-SMCC non disciolto o devono essere utilizzate aliquote disponibili da 2 mg.
   1. Diluire αDEC-205 in PBS in modo che 2,5 mg siano contenuti in 900 μL.
   2. Miscelare 2,5 mg di αDEC-205 (volume di 900 μL; ottenuto dalla fase 3.2.1.) e 100 μL di sulfo-SMCC (ottenuto dalla fase 3.2.) in una provetta da 1,5 mL, ottenendo un volume totale di 1 mL.
   3. Incubare la soluzione αDEC-205/sulfo-SMCC per 30 minuti a 37 °C e 550 giri/min in un blocco riscaldante.
3. A seguito di queste incubazioni, l'eccesso di solfo-SMCC e TCEP-HCl viene immediatamente rimosso dalle soluzioni utilizzando colonne di desalinizzazione (MWCO 7 kDa; 5 mL di volume della colonna).
   1. Svitare la chiusura inferiore delle colonne (MWCO 7 kDa), allentare il tappo e posizionare la colonna in una provetta conica da 15 mL.
   2. Centrifugare per 2 minuti a 1.000 x g a temperatura ambiente per eliminare il liquido.
   3. Posizionare la colonna in un tubo nuovo e rimuovere il tappo. Caricare lentamente l'anticorpo/sulfo-SMCC e l'OVA/TCEP-HCl, rispettivamente, al centro del letto di resina compatta di una colonna ciascuno.
   4. Centrifugare per 2 minuti a 1.000 x g a temperatura ambiente.
   5. Eliminare le colonne dopo l'uso. Le soluzioni contenenti anticorpi e OVA preparate per la coniugazione si trovano nelle provette.
   6. Miscelare immediatamente entrambe le soluzioni mediante pipettaggio per la coniugazione di αDEC-205 e OVA.
   7. Incubare la miscela risultante di αDEC-205 e OVA per una notte a 4°C.
4. Dopo la coniugazione, l'eccesso di OVA non legato viene rimosso dalla soluzione e l'αDEC-205/OVA accoppiato viene concentrato utilizzando un concentratore di proteine centrifughe (MWCO 150 kDa).
   1. Pre-risciacquare il concentratore di proteine centrifugo (MWCO 150 kDa) pipettando 12 mL di PBS sulla colonna e centrifugando per 2 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente.
      nota: Se necessario, ripetere la fase di centrifugazione (3.4.1.) fino a quando un volume di circa 5 mL è passato attraverso la colonna.
   2. Prima di caricare l'αDEC-205/OVA sul concentratore di proteine centrifugo, conservare un campione di 20 μl dell'αDEC-205/OVA non concentrato per l'analisi del western blot. Conservare questa aliquota a 4 °C fino all'analisi.
   3. Caricare l'αDEC-205/OVA sul concentratore di proteine centrifugo mediante pipettaggio.
      nota: Evitare qualsiasi contatto con il letto della camera superiore del concentratore centrifugo.
   4. Riempire il concentratore fino a 15 mL con PBS e centrifugare il concentratore per 5 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente.
   5. Salvare un campione del flusso continuo (flusso continuo I) per l'analisi del western blot ed eliminare il flusso rimanente.
   6. Riempire il concentratore fino a 10 ml di PBS e centrifugare il concentratore per almeno 8 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente.
   7. Conservare un campione per il secondo flusso continuo (flusso continuo II) per l'analisi western blot ed eliminare il flusso rimanente.
   8. Una volta raggiunto l'arricchimento desiderato (circa 1,5 mL della soluzione αDEC-205/OVA devono essere lasciati nella camera superiore), aspirare delicatamente il campione concentrato.
      nota: Se rimane troppo liquido nella camera superiore, la centrifugazione può essere ripetuta ma deve essere mantenuta il più breve possibile.
5. Determinare la concentrazione proteica dell'αDEC-205/OVA risultante utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. Usa PBS come vuoto.
6. Filtrare l'αDEC-205/OVA utilizzando un'unità filtrante a siringa da 0,22 μm.
   nota: Per analisi successive ed esperimenti in vivo, αDEC-205/OVA può essere conservato a 4 °C o -18 °C.

4. Verifica della coniugazione chimica mediante ELISA

1. Eseguire l'ELISA per un'ulteriore verifica della riuscita coniugazione chimica con conseguente αDEC-205/OVA.
2. Rivestire un'appropriata piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di anticorpo αOVA di coniglio da 3 ng/μL nel tampone di rivestimento (bicarbonato di sodio 0,1 M (NaHCO₃) pH 9,6 diluito in H₂O).
   1. Incubare la piastra per una notte a 4 °C.
3. Dopo il rivestimento, lavare la lastra tre volte con PBS, ad esempio utilizzando una lavatrice ELISA.
4. Bloccare la piastra pipettando 200 μl di tampone bloccante (10% FCS in PBS) in ciascun pozzetto della piastra e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente.
5. Diluire in serie αDEC-205/OVA (ottenuto dal passaggio 3.6.) 1:2 in tampone bloccante (10% FCS in PBS) per ottenere diluizioni che vanno da 6 μg/mL fino a 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA e aggiungere 100 μL/pozzetto di queste quantità decrescenti di αDEC-205/OVA ai pozzetti.
   1. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Lavare la piastra tre volte con PBS, ad esempio utilizzando una lavatrice ELISA.
7. Aggiungere 100 μl dell'anticorpo αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO di capra [diluito a 1:2.000 in tampone bloccante (10% FCS in PBS)) a ciascun pozzetto della piastra.
   1. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
8. Lavare la piastra tre volte con PBS, ad esempio con una lavatrice ELISA.
9. Aggiungere 50 μl di substrato HRPO ai pozzetti. Quando si osserva una reazione di colore chiaro, arrestare la reazione aggiungendo 150 μl di soluzione di arresto (1M H₂SO₄) per pozzetto.
10. Dopo 5 minuti, leggere l'assorbimento a 450 nm utilizzando un lettore ELISA.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Buffer di blocco (ELISA)			10 % FBS in PBS
Pallone per coltura cellulare T25	Greiner Bio-One	690175	utilizziamo matracci per colture cellulari con tappo filtrante standard CELLSTAR; in alternativa utilizziamo palloni per colture in sospensione (690195 )
Pallone per coltura cellulare T75	Greiner Bio-One	658175	utilizziamo matracci per colture cellulari con tappo filtrante standard CELLSTAR; in alternativa utilizziamo palloni per colture in sospensione (658195)
Pallone per coltura cellulare T175	Greiner Bio-One	661175	utilizziamo matracci per colture cellulari standard con tappo filtrante CELLSTAR; in alternativa utilizziamo palloni per colture in sospensione (661195)
Concentratore centrifugo MWCO 10 kDa	Sartorius	VS2001	Concentratore centrifugo Vivaspin 20
Concentratore di proteine centrifugo MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Scientifico	Codice 88532	Concentratore di proteine Pierce, PES 5 -20 ml; utilizziamo il concentratore Pierce 150K MWCO 20mL (numero di catalogo 89921), che tuttavia non è più disponibile
Flaconi da centrifuga	Nalgene	525-2314	PPCO (polipropilene copolimero) con chiusura a vite in PP (polipropilene), 500 ml; prodotto da VWR, Germania
Tampone di rivestimento (ELISA)			0,1 M di bicarbonato di sodio (NaHCO3) in H2O (pH 9,6)
Colonne di desalinizzazione MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Scientifico	Codice 89891	Thermo Scientific Colonne di desalinizzazione Zeba Spin, 7K MWCO, 5 mL
Reagente di rilevamento ELISA (substrato HRPO)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	Sistema di substrato liquido 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB)
Piastra ELISA a 96 pozzetti	Thermo Fisher Scientifico	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno Piastra
Siero fetale di vitello	PAN-BIOtech	P40-47500	FBS Buon punto di forza
ISF-1 medio	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
Ibridoma NLDC-145	ATCC	HB-290	se non già a portata di mano, le cellule di ibridoma possono essere acquisite da ATCC
Ovoalbumina	Hyglos (tramite BioVendor)	Codice 321000	EndoGrade OVA ultrapuro con <0,1 EU/mg
Penicillina/Streptomicina	Thermo Fisher Scientifico	15140122	Gibco Penicillina/Streptomicina 10.000 U/ml; in alternativa Gibco Penicillina/Streptomicina 5.000 U/ml (15070-063) può essere utilizzato
Flaconi a rullo per colture cellulari in polietilene tereftalato glicole PETG	Nunc In Vitro	734-2394	con rivestimento PDL, ventilato (1,2X), 1050 cm², volume 100 - 500 ml; prodotto da VWR, Germania
Strisce indicatrici di pH	Merck	109535	Strisce indicatrici di pH 0-14
Anticorpo policlonale di capra αrat-IgG+IgM-HRPO (ELISA)	Jackson ImmunoResearch	Codice 112-035-068	ottenuto da Dianova, Germania; utilizzato in 1:2000 per ELISA
αOVA policlonale di coniglio (ELISA)	Abcam	ab181688	Utilizzato a 3 ng/μl
Proteina G Colonna di sefarosio	Merck/Millipore	P3296	5 ml di proteina G sefarosio, Fast Flow sono confezionati in una colonna vuota PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
Tappo in gomma	Omnilab	5230217	Tappi in gomma DEUTSCH & NEUMANN (inferiore Φ 17 mm; superiore Φ 22 mm)
Tubo in silicone	Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (interno Φ 1 mm; esterno Φ 3 mm)
Sottile-Veloce			abbiamo usato il normale cioccolato Slim-Fast disponibile gratuitamente in farmacia poiché in questo approccio western blot ha prodotto risultati migliori rispetto al latte in polvere
Soluzione di arresto (ELISA)			1 milione di H2SO4
Sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientifico	Codice 22322	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; in alternativa utilizzare il numero di catalogo A39268 (10 x 2 mg)
Unità filtro siringa 0,22 μm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Unità filtro per siringa Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, sterilizzazione gamma
Siringa 10 ml	Omnilab		Siringhe monouso Injekt® Solo B.Braun
Cannule Sterican®	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0,90 x 40 mm; giallo
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A35349
Connettore per tubi	Omnilab		Connettori per tubi miniaturizzati Kleinfeld per tubo in silicone