Saggio della cometa per il rilevamento del danno al DNA nelle cellule

Abstract

Fonte: Ji, Y., et al. Un approccio di analisi della cometa ad alto rendimento per la valutazione del danno al DNA cellulare. J. Vis. Exp. (2022).

Il video mostra il test della cometa per rilevare danni al DNA in seguito all'esposizione ad agenti nocivi. In condizioni alcaline, il DNA si srotola e si denatura, e dopo l'elettroforesi, il DNA integro e danneggiato migra in modo diverso nel gel di agarosio, formando una struttura a forma di cometa. Il DNA intatto che migra lentamente forma la testa circolare della cometa, mentre i frammenti di DNA danneggiati che migrano rapidamente formano la coda allungata della cometa.

Protocollo

1. Preparazione dei materiali per il saggio della cometa

1. Preparazione dei vetrini da microscopio
   1. Versare l'agarosio all'1% (p/v) con punto di fusione normale [disciolto in acqua distillata doppia (ddH₂O)] in una provetta da 50 mL e nel microonde per sciogliere l'agarosio nel ddH₂O. Conservare a 37 °C per evitare la solidificazione prima dei vetrini di rivestimento. In caso di solidificazione, scartare e preparare fresco.
   2. Pre-rivestimento dei vetrini da microscopio immergendoli nella provetta da 50 mL contenente l'1% (p/v) di agarosio con punto di fusione normale.
   3. Pulisci rapidamente il retro delle diapositive dopo averle immerse.
      nota: La mancata pulizia corretta del retro dei vetrini aumenterà il rumore di fondo dei vetrini durante l'analisi passo al microscopio.
   4. Etichettare il vetrino rivestito con un pennarello indelebile nell'angolo in basso a destra della sezione smerigliata (Figura 1A). Questo mostra quale lato della diapositiva è pre-rivestito.
   5. Lasciare riposare l'agarosio e asciugarlo per una notte a temperatura ambiente.
   6. Avvolgere i vetrini secchi in carta velina e conservarli in una scatola.

2. Preparazione dei campioni

1. Cellule in coltura
   nota: In primo luogo, trattare le cellule con l'agente o gli agenti dannosi prima di iniziare il test della cometa. Quindi, procedi come segue.
   1. Se le cellule sono aderenti, tripsinizzare le cellule per liberarle dal pallone di coltura cellulare o dalle piastre di Petri per colture cellulari, alla confluenza appropriata di cellule. Neutralizzare la tripsina aggiungendo terreni contenenti siero.
   2. Trasferire le cellule in una provetta da 50 mL, centrifugare (ad esempio, per HaCaT, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente), rimuovere delicatamente il surnatante e aggiungere 1 mL di PBS al pellet cellulare.
   3. Eseguire il conteggio delle cellule.
   4. Trasferire 30.000 cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 7.607 x g per 5 minuti a 4 °C.
   5. Rimuovere delicatamente il surnatante e conservare il pellet cellulare su ghiaccio al buio prima di eseguire il test della cometa.
      nota: Le cellule devono essere regolarmente testate per la contaminazione da micoplasma prima di eseguire il test della cometa per prevenire, tra gli altri effetti, la formazione di danni artefatti al DNA e una risposta alterata al danno al DNA, come riportato. Le condizioni di centrifugazione possono essere modificate, se necessario, a seconda del tipo di cella utilizzata.
2. Preparazione di cellule in coltura per il saggio di riparazione
   1. Cellule di coltura nel pallone per coltura cellulare o nelle piastre di Petri.
   2. Lavare le cellule con 1 mL di PBS due volte prima di trattare le cellule con agenti dannosi (ad esempio, per le cellule BE-M17, trattare con 50 μM di H₂O₂ per 20 minuti) su ghiaccio per evitare che la riparazione avvenga durante il trattamento.
   3. Lavare delicatamente le cellule con 1 mL di PBS due volte per rimuovere eventuali agenti dannosi residui.
   4. Reintrodurre il terreno di coltura cellulare e lasciare che le cellule si riparino per periodi variabili (ad esempio, 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h e 30 h) in un incubatore umidificato (37 °C, 5% CO₂).
   5. In ogni momento, raccogliere 30.000 cellule in un terreno di coltura cellulare contenente dimetilsolfossido (DMSO) al 10% e conservarle a -80 °C.
   6. Prima di eseguire il saggio della cometa, scongelare rapidamente le cellule a 37 °C in un bagno d'acqua e centrifugarle a 7,607 x g per 5 minuti a 4 °C.
   7. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet cellulare in ghiaccio prima di eseguire il test (cioè dal passaggio 3).

3. Lisi cellulare

NOTA: Esegui tutte le procedure sul ghiaccio.

1. Utilizzare 12.000 cellule o 2,5 μL di sangue intero per gel.
2. Preparare l'agarosio allo 0,6% (p/v) a basso punto di fusione disciolto in PBS utilizzando un forno a microonde e porre a bagnomaria a 37 °C per evitare che si solidifichi.
3. Etichettare l'estremità smerigliata dei vetrini pre-patinati con il nome, la data e le informazioni sul trattamento dello sperimentatore utilizzando un pennarello indelebile o una matita.
4. Posizionare una piastra di raffreddamento su una panca piana e inserire le due confezioni di raffreddamento congelate nel cassetto scorrevole sotto la superficie metallica (come mostrato nella Figura 2).
5. Posizionare i vetrini sulla piastra di raffreddamento e lasciare che i vetrini si raffreddino per 1-2 minuti prima di aggiungere le celle contenenti agarosio a basso punto di fusione allo 0,6% (p/v).
   nota: Lasciare i vetrini sulla piastra di raffreddamento per più di 1-2 minuti può causare la formazione di condensa sulla superficie del vetrino a causa dell'umidità ambientale. Questo può rendere i gel di agarosio a basso punto di fusione meno stabili sui vetrini.
6. Disperdere il pellet (passaggio 2.2.7) mediante vortex. Assicurarsi che tutto il surnatante sia stato rimosso dal pellet. Riposizionare immediatamente le provette del campione (contenenti le celle pellettate) sul ghiaccio.
   nota: Quando si posizionano le provette contenenti campioni nella centrifuga, posizionarle con la cerniera rivolta verso l'esterno in modo che il pellet venga raccolto su questo lato della provetta. A volte è difficile vedere il pellet ed è facile rimuoverlo mentre si rimuove il surnatante. La centrifugazione con il coperchio della provetta in questo orientamento consentirà di sapere dove sarà il pellet della cella.
7. Risospendere il pellet cellulare con 200 μl di agarosio a basso punto di fusione allo 0,6% (agarosio LMP) e miscelare pipettando su e giù senza creare bolle. Quindi, trasferire rapidamente 80 μl di cellule contenenti agarosio LMP su un vetrino refrigerato e posizionare rapidamente un vetrino coprioggetti sul gel.
8. Lasciare riposare il gel sulla piastra di raffreddamento per 1-2 minuti.
9. Nel frattempo, preparare una soluzione di lavoro da 500 mL di tampone di lisi (Tabella 1) e versarla nel piatto di lisi (Figura 3).
10. Una volta che i gel sono stati fissati, rimuovere rapidamente i vetrini coprioggetti tenendo delicatamente il vetrino tra il pollice e l'indice e facendo scivolare il vetrino coprioggetti fuori dal gel.
11. Posizionare i vetrini contenenti i campioni all'interno del supporto dei vetrini (tutti i segni di "punti" neri sui vetrini devono essere rivolti nella stessa direzione quando vengono posizionati in un supporto) (Figura 1B), quindi posizionare il supporto dei vetrini all'interno del piatto di lisi (Figura 3).
12. Chiudere il coperchio della capsula di lisi e conservare la capsula di lisi in frigorifero per una notte a 4 °C o 30 minuti a temperatura ambiente, a seconda di quale si adatti meglio all'orario dell'operatore.

4. Elettroforesi

1. Rimuovere con cautela il supporto del vetrino dal piatto di lisi. Fare attenzione a non disturbare i gel.
2. Posizionare delicatamente il supporto per vetrini in una bacinella precaricata con ddH₂O ghiacciato e lasciarlo per 30 minuti assicurandosi che i vetrini siano completamente coperti con ddH₂O.
3. Inserire una confezione di raffreddamento congelata all'interno del cassetto scorrevole sotto il serbatoio dell'elettroforesi per mantenere la temperatura tampone ottimale.
4. Aggiungere con cautela la soluzione di lavoro per elettroforesi ghiacciata (Tabella 1) al serbatoio dell'elettroforesi e trasferire il supporto del vetrino nel serbatoio dell'elettroforesi. Orientare i vetrini in modo tale che le loro parti trasparenti con i gel contenenti celle (cioè NON le estremità smerigliate/di etichettatura) puntino verso il catodo (elettrodo rosso).
5. Lasciare riposare i vetrini nella vasca dell'elettroforesi per 20 minuti in modo che il DNA si rilassi e si srotoli. Tenere l'alimentazione spenta durante questo passaggio.
6. Se necessario, inserire una nuova confezione di raffreddamento congelata per massimizzare il raffreddamento.
7. Eseguire l'elettroforesi per 20 minuti a 1,19 V/cm, o qualsiasi condizione sia stata ottimizzata.
   nota: L'ottimizzazione delle condizioni di funzionamento dell'elettroforesi e del volume del tampone è consigliata per ogni laboratorio. L'utilizzo di un solo supporto per vetrini durante l'elettroforesi non causa alcun effetto dei vetrini sulla resistenza del tampone per elettroforesi e gli autori non hanno visto un effetto significativo nella tensione o nella corrente quando il numero dei vetrini cambiava.
8. Spegnere l'alimentazione, rimuovere con cautela il supporto del vetrino dal serbatoio dell'elettroforesi e lasciarlo scolare su carta velina per 30 s.
9. Posizionare il supporto del vetrino nella piastra contenente il tampone di neutralizzazione (Tabella 1). Lasciare agire per 20 min.
10. Rimuovere il supporto del vetrino dalla capsula di neutralizzazione, metterlo nella vaschetta di lavaggio contenente ddH2O ghiacciato e lasciarlo agire per 20 minuti.
11. Togliere il supporto del vetrino dall'acqua e lasciare asciugare i vetrini in un'incubatrice a 37 °C per 1 ora, o a temperatura ambiente per una notte, oppure non asciugarli, a seconda del programma dell'operatore.
    nota: Se non c'è asciugatura al punto 4.11, eseguire il passaggio di colorazione dal punto 5.2.

5. Colorazione con ioduro di propidio (PI)

1. Trasferire il supporto per vetrini in una leccarda contenente ddH₂O ghiacciato per reidratare i vetrini e lasciare agire per 30 minuti.
2. Posizionare il supporto del vetrino in una capsula di colorazione contenente 2,5 μg/mL di soluzione di ioduro di propidio.
   nota: Lo ioduro di propidio è sensibile alla luce, quindi maneggialo in un'area buia. È anche tossico.
3. Chiudere il coperchio della vaschetta per la colorazione e incubarla per 20 minuti al buio a temperatura ambiente.
4. Trasferire il supporto per vetrini in un piatto separato e lavarlo con ddH₂O ghiacciato per 20 minuti.
5. Rimuovere il supporto del vetrino dalla capsula e asciugarlo completamente al buio, in un'incubatrice a 37 °C o a temperatura ambiente, a seconda del programma o delle preferenze dell'operatore.
6. Una volta che i vetrini sono completamente asciutti, rimuoverli dal supporto per vetrini e conservarli in una scatola per vetrini al buio fino al momento dell'analisi delle immagini.
   nota: I vetrini rimarranno leggibili a tempo indeterminato e potranno essere ricolorati se necessario.

6. Punteggio delle comete e analisi dei dati

NOTA: Il termine "cometa" deriva dalle immagini delle cellule danneggiate quando vengono osservate al microscopio dopo che il test è stato eseguito (Figura 4). In condizioni di elettroforesi, il DNA nelle cellule non danneggiate in gran parte non migra, ma rimane in uno sferoide definito come "testa" di cometa. Tuttavia, la presenza di rotture del filamento consente al DNA della cellula di migrare fuori dalla testa e formare una "coda", portando così a un aspetto simile a una cometa (Figura 4). Più DNA c'è nella coda, più danni sono presenti.

1. Accendi il microscopio a fluorescenza con il filtro PI (rosso) (λ = 536/617 nm) e il software di punteggio del saggio delle comete.
2. Aggiungere una goccia d'acqua con una pipetta Pasteur al gel e coprire con un vetrino coprioggetti.
3. Posiziona i vetrini nel microscopio a fluorescenza e "segna" le comete.
   nota: Il punteggio è un mezzo con cui vengono valutate le comete, per determinare la quantità di danni presenti in ciascuna cometa. In generale, questo può essere ottenuto utilizzando due approcci, a seconda delle preferenze scelte dall'utente, sia a occhio (misurando le dimensioni delle comete su una scala da zero a quattro) sia utilizzando software liberamente o disponibili in commercio. In generale, entrambi gli approcci valutano le dimensioni della coda della cometa, anche se è possibile determinare una varietà di endpoint correlati alla cometa. Se si utilizza il software, fare clic sul centro della testa della cometa e attendere che il software rilevi automaticamente la cometa, quindi valuti il punto finale scelto (Figura 4).
4. Assegna un punteggio di 50 comete per gel e 100 comete per campione (cioè, ogni campione corrisponde a diversi trattamenti dannosi per il DNA o alle loro repliche).
5. Replicare gli esperimenti (n = 2) o triplicare gli esperimenti (n = 3).
   nota: Se vengono intrapresi solo n=2 esperimenti di replica, l'analisi statistica non può essere eseguita, ma se n=3, eseguire il test di normalità di D'agostino. La maggior parte dei dati del saggio delle comete non supera un test di normalità. In questo caso, utilizzare un test non parametrico (test di Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn e la significatività dei test di Mann-Whitney impostata a p < 0,05).

Reagente	Soluzione madre	Soluzione funzionante
Tampone di lisi	100 mM Na2EDTA, 2,5 M NaCl e 10 mM Tris Base in ddH2O; regolare il pH a 10 con 10 M NaOH	Triton X-100 all'1% in soluzione madre di lisi
Tampone per elettroforesi	10 M NaOH e 200 mM Na2EDTA in ddH2O	300 mM NaOH e 1 mM Na2EDTA; pH > 13
Tampone di neutralizzazione	Tris Base 0,4 M in ddH2O; regolare il pH a 7,5 con HCl
Tampone di colorazione	1 mg/mL di ioduro di propidio	2,5 μg/mL di ioduro di propidio in ddH2O

Tabella 1: Composizione dei reagenti utilizzati nel saggio alcalino su comete ad alto rendimento (HTP ACA). Vengono mostrate le concentrazioni stock e di lavoro dei tamponi di lisi, elettroforesi, neutralizzazione e colorazione.

Risultati

Figura 1: Immagini rappresentative di un vetrino per il saggio di una cometa e di un rack HTP (supporto per vetrini da microscopio). (A) Per un corretto orientamento, la faccia pre-rivestita del vetrino del microscopio è riconosciuta da un punto nero nell'angolo destro di un vetrino da microscopio. (B) L'immagine del rack HTP illustra come i vetrini siano mantenuti in uno stretto orientamento vertica...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
vetrini coprioggetti 22 x 22 mm	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stati Uniti	Codice 631-0124
Microscopio a fluorescenza equipaggiato con una fotocamera	Zeiss, Jena, Germania
Sistema di analisi HTP Comet	Mannaia scientifica	COMPAC- 50
Cheratinociti umani (HaCaTs)	Collezione di cultura di tipo americano (ATCC), Manassas, VA, Stati Uniti	Interrotto	Può essere acquistato da un altro azienda ADDEXBIO TECHNOLOGIES Gatto# T0020001
Perossido di idrogeno (H2O2) 30% in acqua	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stati Uniti	BP2633-500
Software per l'analisi di immagini e dati	Strumento percettivo, Bury St Edmunds, Inghilterra Regno Unito	125525	Software gratuito per l'analisi delle immagini is disponibile, ad esempio, ImageJ
Basso punto di fusione Agarosio	Invitrogen Waltham, MA, Stati Uniti	P4864
Na2 EDTA (disodio acido etilendiamminotetraacetico)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	E5134
NaCl (cloruro di sodio)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	S7653
Acqua ultrapura Nanopure Infinity Sistema (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	D11901	Acqua ultrapura (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (idrossido di sodio)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	E5134
Punto di fusione normale Agarosio	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stati Uniti	16520100	Per vetrini di pre-rivestimento
Iodio di propidio (1,0 mg/mL in acqua)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	12-541BP486410ML
Microscopio in vetro smerigliato singolo Diapositive	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stati Uniti	Codice 12-541B
Casella di scorrimento	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stati Uniti	03-448-2	A prova di luce, per proteggere le cellule da la formazione danno avventizio (secondo l'opinione diffusa) e prevenire lo sbiadimento del fluorescente tingere
Piastra di raffreddamento scorrevole	Mannaia Scientifica, Rugby, Inghilterra, Regno Unito	CSL-CHILLPLATE
Piatto di trattamento	Mannaia Scientifica, Rugby, Inghilterra, Regno Unito	STAINDISH4X
Tris-base	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	Codice 93362
Triton X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, Stati Uniti	BP151-500
Tripsina EDTA (0,5%)	Invitrogen Gibco, Waltham, MA, Stati Uniti	15400054
Supporto per vetrini verticali	Mannaia Scientifica, Rugby, Inghilterra, Regno Unito	COMPAC-25