L'uso di materiali radioattivi (RAM) richiede l'approvazione preventiva da parte di un comitato di sicurezza designato in ogni istituzione.
1. Assorbimento di aminoacidi nelle cellule
- Piastra 5 x 104 cellule ST2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti. Cellule su piastra in α-MEM contenenti il 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina e 0,1 μg/mL di streptomicina (Pen/Strep). Piastra pozzetti extra di cellule per quantificare il numero di cellule per condizione per le normalizzazioni nel passaggio 1.12. Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 °C con CO2 al 5%.
- Coltivare le cellule per 2-3 giorni fino a quando non diventano confluenti.
- Il giorno dell'esperimento, preparare le seguenti soluzioni: 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4 e tampone Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-glucosio). Preriscaldare a 37 °C.
- Aspirare il terreno e lavare le cellule due volte con 1 mL di 1x PBS, pH 7,4,
nota: Questo protocollo è adatto anche per la divisione rapida di cellule non confluenti. In questo caso, è importante normalizzare la radioattività al numero assoluto di cellule o al contenuto di DNA. Inoltre, prendere in considerazione l'aumento delle dimensioni della piastra di coltura o del pallone per aumentare il numero complessivo di cellule e i valori cpm. Questo è importante da determinare empiricamente su base individuale.
- Aspirare 1x PBS e lavare le cellule una volta con 1 mL di KRH.
- Produrre 4 μCi/mL di terreno di lavoro L-[3,4-3 H]-glutammina diluendo 4 μL di [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-glutammina stock per 1 mL di KRH.
nota: Prima di utilizzare materiali radioattivi, contattare l'Ufficio per la sicurezza dalle radiazioni presso il proprio istituto di origine per ottenere le approvazioni. Tutte le procedure relative alle radiazioni devono essere eseguite dietro lo schermo in plexiglass.
- Incubare le cellule con 0,5 mL di KRH contenenti 4 μCi/mL di terreno di lavoro L-[3,4-3 H]-Glutammina per 5 minuti.
- Raccogliere il mezzo radioattivo ed erogarlo nel contenitore dei rifiuti liquidi. Lavare brevemente le cellule tre volte con KRH ghiacciato per terminare la reazione. Raccogliere e gettare tutti i lavaggi nel contenitore dei rifiuti liquidi radioattivi.
- Aggiungere 1 mL di SDS all'1% in ciascun pozzetto e triturare 10x per lisare e omogeneizzare le cellule. Trasferire i lisati cellulari in provette da 1,5 mL. Gettare le piastre per colture cellulari, le pipette sierologiche e i puntali delle pipette nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.
- Centrifugare a >10.000 x g per 10 minuti. Trasferire i surnatanti in fiale di scintillazione contenenti 8 mL di soluzione di scintillazione. Mescolare agitando energicamente le fiale di scintillazione. Gettare le provette e i puntali delle pipette nel contenitore dei rifiuti radioattivi solidi.
- Leggere la radioattività in conteggi al minuto (cpm) utilizzando un contatore a scintillazione. Gettare le fiale di scintillazione nel contenitore dei rifiuti delle fiale di scintillazione.
- Tripsinizzare, risospendere e contare le cellule dalle restanti piastre di cellule non radioattive (vedere il passaggio 1.1) per stimare il numero di cellule nelle colture radioattive lisate. Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule per pozzetto non radioattivo per ogni condizione sperimentale. Normalizzare il cpm dal passaggio 1.11 al numero stimato di cellule dalle piastre non radioattive.
- Al termine dell'esperimento, decontaminare la cappa di coltura cellulare, il banco e tutti gli strumenti con uno spray decontaminante radioattivo. Infine, eseguire i test di pulizia per assicurarsi che l'area di lavoro sia priva di radiazioni.
