1. Cultura sincronizzata di C. elegans
- Prima della semina, coltivare il ceppo OP50 di Escherichia coli (E. coli) per una notte a 37 °C in 300 mL di brodo di terreno liquido Luria-Bertani (LB). Conservare l'OP50 in coltura a -4 °C.
- Per rendere il brodo LB liquido medio, utilizzare 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 10 g di NaCl e 1,5 ml di 1 N NaOH e aggiungere a 1 litro con acqua deionizzata. Autoclave.
nota: I ceppi OP50 e C. elegans sono disponibili presso il Caenorhabditis Genetics Center (Università del Minnesota, St. Paul, MN, USA).
- Per preparare l'agar del terreno di crescita dei nematodi (NGM), utilizzare 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone, 17 g di agar e 975 ml di acqua deionizzata. Autoclave. Raffreddare a 55 °C, quindi aggiungere sterile, nell'ordine, 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di 5 mg/mL di colesterolo in EtOH e 25 mL di 1 M di fosfato di potassio pH 6,0 in piastre di Petri da 90 mm.
- Per 1 M di fosfato di potassio pH 6,0, utilizzare 108,3 g di KH2PO4 e 46,6 g di K2HPO4 e aggiungere acqua deionizzata a 1 L. Autoclave.
- Distribuire 1-2 mL di OP50 in coltura sulle piastre di agar NGM. Per fare uno strato sottile di OP50, incubare le piastre per una notte a temperatura ambiente prima di aggiungere qualsiasi nematode.
nota: Le piastre di agar NGM inoculate OP50 possono essere conservate a temperatura ambiente per 2-3 settimane.
- Aggiungere almeno 100 vermi su una piastra di agar NGM con OP50 e coltivare a 20 °C fino allo stadio adulto. Sono necessarie almeno tre targhe.
- Per raccogliere gli ovuli in utero, trasferire gli ermafroditi gravidi dalle tre piastre di agar NGM ciascuna con 5 mL di tampone S in una provetta conica da 15 mL e lavare i vermi 3 volte con 15 mL di tampone S utilizzando la centrifugazione a 300 x g per 30 s a temperatura ambiente.
- Per preparare il tampone S, utilizzare 5,9 g di NaCl e 50 ml di fosfato di potassio 1 M pH 6,0 e aggiungere a 1 litro con acqua deionizzata. Autoclave.
- Sciogliere i vermi in una soluzione alcalina di ipoclorito per l'assenizzazione e l'isolamento delle uova di massa (0,5 ml di candeggina fresca o equivalente: ipoclorito di sodio al 5-6%, 0,1 ml di NaOH 10 M, circa 4,5 ml di tampone S) e far riposare la soluzione per 10-15 minuti a temperatura ambiente mescolando invertendo.
nota: Entro 15 minuti, i vermi adulti dovrebbero dissolversi, lasciando una soluzione nebulosa di uova liberate dalle loro carcasse (le uova liberate dovrebbero essere confermate utilizzando un microscopio stereoscopico). Invece di 0,1 mL di NaOH 10 N, è possibile utilizzare anche 0,2 mL di NaOH 5 N.
- Dopo il trattamento con ipoclorito, lavare il pellet d'uovo 3 volte con 15 mL di tampone S e risospendere in 5-6 mL di tampone S. Far schiudere le uova rilasciate durante un'incubazione notturna a 20 °C in tampone S senza E. coli per una coltura sincrona all'età di larve allo stadio L1.
- Per determinare il numero approssimativo di larve allo stadio L1, contare i vermi utilizzando un microscopio stereoscopico in 10 μL di tampone S dopo aver risospeso le larve almeno 3 volte e calcolare la media. Quindi, trasferire le larve dello stadio L1 in cinque piastre di agar NGM con OP50 (1.500-3.000 vermi per piastra utilizzando una piastra di Petri da 90 mm) e coltivare a 20 °C fino a quando non sono cresciute fino allo stadio di giovane adulto, quando inizia l'autofecondazione e vengono deposte alcune uova (normalmente dopo 3 giorni).
2. Estrazione della frazione cellulare da C. elegans
- Raccogli i vermi allo stadio di giovani adulti (animali di 5 giorni) dalle cinque piastre di agar NGM con tampone S (Figura 1A).
- Per selezionare solo vermi vivi utilizzando il metodo 6 del saccarosio per la flottazione con saccarosio al 30% (p/v), mescolare i vermi sospesi in 3-4 mL di tampone S con un volume uguale di saccarosio ghiacciato al 60% (p/v) in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare la provetta a 1.500 x g per 15 s a 4 °C e rimuovere i vermi galleggianti in una provetta nuova spostandoli dalla parete della provetta con una pipetta Pasteur.
- Lavare i vermi 3 volte con il tampone S mediante centrifugazione a 1.500 x g per 30 s a 4°C. Controllare il volume umido dei vermi lavati dopo la centrifugazione utilizzando un puntale per micropipette da 1.000 μl (Figura 1B).
- Aggiungere i vermi lavati a un volume uguale di acido tricloroacetico (TCA) al 10% (p/v) ghiacciato per la precipitazione delle proteine (Figura 1C). Al posto del TCA, è possibile utilizzare l'acido perclorico (PCA) o l'acido metafosforico.
- Omogeneizzare i vermi con il precipitante utilizzando 40 colpi di pestello in un omogeneizzatore di teflon (trituratore di tessuti Potter-Elvehjem) con rotazione fino a 1.300 giri/min sul ghiaccio.
- Trasferire l'omogeneizzato in una microprovetta fresca da 1,5 ml con una pipetta Pasteur e sonicare utilizzando un omogeneizzatore a ultrasuoni per 3 minuti (3 volte di 1 minuto) con un ciclo di lavoro del 20% con ghiaccio.
- Chiarificare l'omogeneizzato mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Neutralizzare i surnatanti con 4 M KOH (0,25 volume a 10% TCA) per 20 minuti su ghiaccio e centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Il surnatante (come campione di prova) può essere conservato a -80 °C fino ai test successivi.
3. Saggio del piruvato utilizzando un kit di analisi colorimetrica
- Misurare la concentrazione di piruvato nei surnatanti (campioni di prova) utilizzando un kit di test colorimetrici (Tabella dei materiali). Eseguire esami duplex per i campioni di prova. Aggiungere 10 μl dei campioni di prova e 90 μl di reagente di lavoro (contenente 94:1 di miscela enzimatica e reagente colorante, forniti con il kit) in una piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti mentre i campioni sono protetti dalla luce.
- Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
- Traccia la curva standard del piruvato. Calcolare le concentrazioni di piruvato dei campioni di prova dalla curva standard del piruvato.
