Saggio spettrofotometrico per determinare l'attività della glicogeno sintasi

Abstract

Fonte: Wilson W.A., Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive un test spettrofotometrico per la stima dell'attività della glicogeno sintasi. Il metodo si basa sulla riduzione dell'assorbanza del NADH con il tempo e indica l'attività della glicogeno sintasi.

Protocollo

1. Determinazione dell'attività della glicogeno sintasi

1. Preparare le soluzioni madre dei reagenti necessari come indicato nella Tabella 1 (prima del giorno dell'esperimento).
2. Il giorno del saggio, preparare una soluzione di lavoro fresca di 4 mM di NADH sciogliendo 4,5 mg di NADH in 1,5 mL di 50 mM di Tris-HCl, pH 8,0. Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce.
3. Scongelare le soluzioni stock di UDP-glucosio, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP chinasi su ghiaccio.
4. Preriscaldare un bagnomaria a 30 °C.
5. Impostare ciascun saggio di glicogeno sintasi in una provetta da 1,5 mL aggiungendo i reagenti della misce....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Amilopectina (senza amilosio) da mais ceroso	Fisher Scientifico	Codice: A0456
amilosio	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, sale disodico	MilliporeSigma	A3377
D-glucosio-1,6-bisfosfato, sale di potassio	MilliporeSigma	G6893
D-glucosio-6-fosfato, sale sodico	MilliporeSigma	G7879
Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, grado I, da lievito	MilliporeSigma	10127655001
Glicogeno di tipo II da ostrica	MilliporeSigma	G8751
esochinasi	MilliporeSigma	11426362001
Cuvette in metacrilato, 1,5 mL	Fisher Scientifico	14-955-128	Il metacrilato è necessario poiché alcune procedure vengono eseguite a 340 nm o inferiori
β-Nicotinammide adenina dinucleotide fosfato sale sodico	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenina dinucleotide, sale disodico ridotto	MilliporeSigma	Numero 43420
Nucleoside 5'-difosfato chinasi	MilliporeSigma	N0379
Fosfoenolpiruvato, sale monopotassico	MilliporeSigma	P7127
Fosfoglucomutasi dal muscolo del coniglio	MilliporeSigma	P3397
Fosforilasi A dal muscolo di coniglio	MilliporeSigma	P1261
Enzimi piruvato chinasi/deidrogenasi lattica dal muscolo del coniglio	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucosio, sale disodico	MilliporeSigma	U4625