Saggio spettrofotometrico per determinare l'attività della glicogeno sintasi

Abstract

Fonte: Wilson W.A., Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive un test spettrofotometrico per la stima dell'attività della glicogeno sintasi. Il metodo si basa sulla riduzione dell'assorbanza del NADH con il tempo e indica l'attività della glicogeno sintasi.

Protocollo

1. Determinazione dell'attività della glicogeno sintasi

1. Preparare le soluzioni madre dei reagenti necessari come indicato nella Tabella 1 (prima del giorno dell'esperimento).
2. Il giorno del saggio, preparare una soluzione di lavoro fresca di 4 mM di NADH sciogliendo 4,5 mg di NADH in 1,5 mL di 50 mM di Tris-HCl, pH 8,0. Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce.
3. Scongelare le soluzioni stock di UDP-glucosio, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP chinasi su ghiaccio.
4. Preriscaldare un bagnomaria a 30 °C.
5. Impostare ciascun saggio di glicogeno sintasi in una provetta da 1,5 mL aggiungendo i reagenti della miscela di reazione elencati nella Tabella 2.
   nota: Per facilitare la messa a punto, è possibile realizzare una miscela master contenente una quantità sufficiente di ciascuno dei reagenti sopra elencati per completare il numero di saggi previsti.
6. Preparare una reazione in bianco, in cui il NADH nella miscela di cui sopra viene sostituito con acqua. Trasferire in una cuvetta monouso in metacrilato e utilizzarla per impostare lo zero sullo spettrofotometro a 340 nm.
7. Prelevare 770 μl dell'aliquota della miscela di reazione in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 2 μl di NDP chinasi e 2 μl di miscela piruvato chinasi/lattato deidrogenasi, mescolare delicatamente e incubare a 30 °C per 3 minuti per preriscaldare la miscela di reazione.
8. Aggiungere 30 μl del campione contenente glicogeno sintasi in 20 mM di tampone Tris, pH 7,8; mescolare e trasferire la miscela di reazione in una cuvetta monouso di metacrilato.
9. Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro e registrare l'assorbanza a 340 nm a intervalli di tempo per 10-20 minuti. Tracciare le assorbanze ottenute rispetto al tempo.
   nota: Deve essere condotta una reazione in cui il campione di glicogeno sintasi viene sostituito con 20 mM di tampone Tris per controllare l'ossidazione non enzimatica del NADH. A seconda della purezza del campione, possono essere necessarie altre reazioni di controllo.
10. Determinare la velocità di reazione.

Tabella 1: Soluzioni stock necessarie per il dosaggio dell'attività della glicogeno sintasi.

componente	Indicazioni
50 mM Tris pH 8.0	Sciogliere 0.61 g di base Tris in ~ 80 mL di acqua. Raffreddare a 4 °C. Regolare il pH a 8,0 con HCl e portare il volume fino a 100 ml con acqua.
Tampone HEPES da 20 mM	Sciogliere 0.477 g di HEPES in ~ 80 mL di acqua. Regolare il pH a 7,0 con NaOH e portare il volume a 100 ml con acqua.
132 mM Tris/32 mM KCl tampone pH 7,8	Sciogliere 1.94 g di base Tris e 0.239 g di KCl in ~90 mL di acqua. Regolare il pH a 7,8 con HCl e portare il volume a 100 ml con acqua.
0,8% p/v Glicogeno di Ostriche	Pesa 80 mg di glicogeno per ostriche e aggiungilo all'acqua. Portare il volume finale a 10 ml con acqua e scaldare delicatamente/mescolare per sciogliere completamente il glicogeno.
100 mM di glucosio UDP	Sciogliere 0.31 g di UDP-glucosio in acqua e portare il volume finale fino a 1 mL. Conservare in aliquote, congelate a -20 °C. Stabile per alcuni mesi.
50 mM ATP	Sciogliere 0.414 g di ATP in ~ 13 mL di acqua. Regolare il pH a 7,5 con NaOH e portare il volume a 15 ml con acqua. Conservare in aliquote congelate a -20 °C. Stabile per alcuni mesi.
100 mM di glucosio-6-fosfato pH 7,8	Sciogliere 0.282 g di glucosio-6-fosfato in ~ 7-8 mL di acqua. Regolare il pH a 7,8 con NaOH. Portare il volume a 10 ml con acqua. Conservare congelato in aliquote a -20 °C. Stabile per almeno sei mesi.
40 mM di fosfoenolpiruvato	Sciogliere 4 mg di fosfoenolpiruvato in 0,5 mL di 20 mM di tampone HEPES pH 7,0. Conservare a -20 °C. Stabile per almeno 1 settimana.
0,5 m MnCl2	Sciogliere 9.90 g di MnCl2 in un volume finale di 100 ml di acqua.
NDP chinasi	Ricostituire la polvere liofilizzata con acqua sufficiente a dare 1 U/μl di soluzione. Preparare le aliquote, congelarle in azoto liquido e conservarle a -80 °C. Stabile per almeno 1 anno.

Tabella 2: Composizione della miscela di reazione per il saggio dell'attività della glicogeno sintasi.

componente	Volume (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl tampone pH 7,8	250
Acqua	179
100 mM di glucosio-6-fosfato, pH 7,8	58
0,8 % p/v glicogeno di ostriche	67
50 mM ATP	80
4 mM NADH	80
100 mM di glucosio UDP	28
40 mM di fosfoenolpiruvato	20
0,5 m MnCl2	8
Volume finale	770

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Amilopectina (senza amilosio) da mais ceroso	Fisher Scientifico	Codice: A0456
amilosio	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, sale disodico	MilliporeSigma	A3377
D-glucosio-1,6-bisfosfato, sale di potassio	MilliporeSigma	G6893
D-glucosio-6-fosfato, sale sodico	MilliporeSigma	G7879
Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, grado I, da lievito	MilliporeSigma	10127655001
Glicogeno di tipo II da ostrica	MilliporeSigma	G8751
esochinasi	MilliporeSigma	11426362001
Cuvette in metacrilato, 1,5 mL	Fisher Scientifico	14-955-128	Il metacrilato è necessario poiché alcune procedure vengono eseguite a 340 nm o inferiori
β-Nicotinammide adenina dinucleotide fosfato sale sodico	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenina dinucleotide, sale disodico ridotto	MilliporeSigma	Numero 43420
Nucleoside 5'-difosfato chinasi	MilliporeSigma	N0379
Fosfoenolpiruvato, sale monopotassico	MilliporeSigma	P7127
Fosfoglucomutasi dal muscolo del coniglio	MilliporeSigma	P3397
Fosforilasi A dal muscolo di coniglio	MilliporeSigma	P1261
Enzimi piruvato chinasi/deidrogenasi lattica dal muscolo del coniglio	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucosio, sale disodico	MilliporeSigma	U4625