Analisi basata sull'impedenza cellulare per il monitoraggio dei processi cellulari in tempo reale

Abstract

Fonte: Labadie, T., et al., Monitoraggio della sopravvivenza del virus dell'influenza al di fuori dell'ospite utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, dimostriamo il processo di monitoraggio in tempo reale degli eventi cellulari, inclusa la proliferazione delle cellule aderenti, tramite un test di impedenza cellulare. Qui, le celle aderenti fungono da isolanti, limitando il flusso di corrente tra gli elettrodi e aumentando l'impedenza.

Protocollo

NOTA: Durante tutti gli esperimenti, tieni sempre le piastre su superfici non elettrostatiche, come gli involucri di carta dalla confezione. Seguire la sezione 1 di seguito per determinare la concentrazione più appropriata di cellule da seminare nella piastra elettronica per microtitolazione (progettata come E-Plate).

1. Determinazione della quantità di cellule appropriata per infettare le cellule

1. Preparare le cellule MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) in² fiasche da 75 cm per ottenere cellule appena divise (circa l'80% di confluenza) 24 ore prima dell'esperimento.
2. Lavare le celle con 5 mL di 1x PBS e staccarle aggiungendo 3 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%.
3. Aggiungere 7 mL di terreno di coltura cellulare fresco e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato con colorazione blu di tripano.
4. Regolare la concentrazione cellulare a 400.000 cellule/mL con terreni di coltura cellulare. Eseguire diluizioni seriali doppie in provette aggiuntive per ottenere densità di celle di 200.000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; e 6.250 cellule/mL. Regolare l'intervallo di diluizione delle cellule in base al tipo di cellula e al loro comportamento di crescita.
5. Lasciare la piastra E (Table of Materials) su RT per alcuni minuti e aggiungere 100 μL di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Non toccare gli elettrodi della piastra elettrica.
6. Sbloccare le culle e inserire l'estremità anteriore della piastra nella tasca della culla dello strumento di misura dell'impedenza (Tabella dei materiali). Chiudere lo sportello dell'incubatrice.
7. Apri il software.
   1. In "Impostazione predefinita del modello di esperimento", scegli la base o le basi selezionate e fai doppio clic sulla pagina superiore, quindi inserisci il nome dell'esperimento. Fare clic su "Layout" e inserire le informazioni necessarie sul campione per ogni pozzetto selezionato della piastra; quindi, fai clic su "Applica" al termine. Fai clic su "Programma" | "Passi" | "Aggiungi un passaggio". Il software aggiunge automaticamente un passo di 1 s per misurare l'impedenza di fondo (CI).
   2. Fare clic su "Avvia/Continua" nella scheda "Esegui". Fare clic su "Traccia", aggiungere tutti i campioni selezionando i pozzetti appropriati e assicurarsi che l'IC sia compreso tra -0,1 e 0,1 prima di procedere con la fase successiva.
8. Rimuovere la piastra dalla base.
9. Aggiungere 100 μl di ciascuna sospensione cellulare dalla fase 1.4 in duplicato ai pozzetti appropriati e 100 μl di terreno cellulare nei pozzetti utilizzati come controlli. Lasciare la piastra E nella cappa a flusso laminare per 30 minuti a RT per consentire una distribuzione uniforme delle cellule sul fondo dei pozzetti.
10. Inserire la piastra E nella tasca della base. Fare clic su "Programma" | "Aggiungi passaggio" nel software e inserire i valori per monitorare le celle ogni 30 minuti per 200 ripetizioni. Quindi, seleziona "Avvia/Continua".
11. Controllare e tracciare i dati CI facendo clic sul pulsante "Traccia" nel software. Selezionare la concentrazione di cellule che si trovano appena prima della fase stazionaria 24 ore dopo la semina sulla piastra, al fine di ottenere cellule che sono ancora in una fase di crescita durante l'infezione virale. La fase stazionaria viene raggiunta quando l'IC è al massimo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
E-Plate 16 (6 piastre)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	Le piastre elettroniche sono disponibili in diverse confezioni
PBS 1X	Tecnologie per la vita (gibco)	14040091
TPCK-Tripsina	Worthington	LS003740
Strumento di analisi cellulare in tempo reale xCELLigence S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Gli strumenti xCELLigence RTCA S16 sono disponibili in diversi formati (16 pozzetti, 96 pozzetti, piastra singola o multipla)
Pallone per coltura tissutale da 75 cm2	Falcone	Codice 430641U
MEM 1X	Tecnologie per la vita (gibco)	31095029