Saggio cellulare basato sull'impedenza per misurare la molteplicità dell'infezione da virus influenzale

Abstract

Fonte: Labadie, T., et al., Monitoraggio della sopravvivenza del virus dell'influenza al di fuori dell'ospite utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, discutiamo la correlazione tra il CIT₅₀ e la molteplicità delle infezioni virali. Le cellule infettate dal virus mostrano effetti citopatici, causando la loro morte e il distacco dal microelettrodo d'oro, che a sua volta riduce l'impedenza.

Protocollo

1. Correlazione tra i valori CIT₅₀ e la molteplicità dell'infezione

1. Aggiungere 100 μl di terreno di coltura sterile 1x MEM in ciascun pozzetto della piastra E. Inserire la piastra E nella tasca della base dello strumento a 35°C.
2. Misura lo sfondo come descritto:
3. Apri il software.
   1. In "Impostazione predefinita del modello di esperimento", scegli la base o le basi selezionate e fai doppio clic sulla pagina superiore, quindi inserisci il nome dell'esperimento. Fare clic su "Layout" e inserire le informazioni necessarie sul campione per ogni pozzetto selezionato della piastra; quindi, fai clic su "Applica" al termine. Fai clic su "Programma" | "Passi" | "Aggiungi un passaggio". Il software aggiunge automaticamente un passo di 1 secondo per misurare l'impedenza di fondo (CI).
   2. Fare clic su "Avvia/Continua" nella scheda "Esegui". Fare clic su "Traccia", aggiungere tutti i campioni selezionando i pozzetti appropriati e assicurarsi che l'IC sia compreso tra -0,1 e 0,1 prima di procedere alla fase successiva.
4. Rimuovere la piastra E dalla base.
5. Seminare 3 x 10⁴ di cellule MDCK appena divise su ciascun pozzetto della piastra elettronica per microtitolazione e farle crescere per 24 ore a 35°C con il 5% di CO₂ in modo che siano in una fase replicativa durante l'infezione da IAV.
6. Infettare le cellule MDCK con diverse diluizioni di 10 volte di un titolo noto di 6log₁₀TCID₅₀/mL di virus H1N1, utilizzando il pipettaggio inverso per la riproducibilità seguendo i passaggi seguenti:
   1. Sciacquare le cellule MDCK 2 volte con 100 μL di MEM senza FCS (mezzi di propagazione del virus). Prestare attenzione a rimuovere tutti i terreni dopo il secondo lavaggio per evitare un'ulteriore diluizione dell'inoculo.
   2. Aggiungere 100 μl di sospensione virale in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta monocanale. Per evitare contaminazioni, procedere partendo da sinistra a destra, quindi dall'alto verso il basso nella piastra coprendo i pozzetti rimanenti con il coperchio.
   3. Inserire la piastra nella tasca della base dello strumento a 35°C. Prestare attenzione per evitare movimenti improvvisi che potrebbero causare contaminazione.
   4. Iniziare a monitorare l'impedenza cellulare ogni 15 minuti per almeno 100 ore come descritto:
      1. Inserire la piastra E nella tasca della base. Fare clic su "Programma" | "Aggiungi passaggio" nel software e inserire i valori per monitorare le celle ogni 30 minuti per 200 ripetizioni. Quindi, seleziona "Avvia/Continua".
   5. Dopo i due cicli di misurazione (cioè 30 min), mettere in pausa l'apparecchio facendo clic su "Pausa" nella scheda "Esegui" e rimuovere la piastra E dalla base.
   6. Aggiungere 1 μg/mL di TPCK-tripsina al terreno di propagazione del virus per scindere l'emoagglutinina virale.
   7. Aggiungere 100 μL di terreno di propagazione del virus contenente TPCK-tripsina in ciascun pozzetto e inserire la piastra E nella tasca del cradle.
   8. Fare clic su "Avvia/Continua" nella scheda "Esegui".
      nota: Non dimenticare di creare un controllo negativo corrispondente alle cellule finte e infette sostituendo la sospensione virale con mezzi di propagazione del virus.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
E-Plate 16 (6 piastre)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	Le piastre elettroniche sono disponibili in diverse confezioni
MEM 1X	Tecnologie per la vita (gibco)	31095029
TPCK-Tripsina	Worthington	LS003740
Strumento di analisi cellulare in tempo reale xCELLigence S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Gli strumenti xCELLigence RTCA S16 sono disponibili in diversi formati (16 pozzetti, 96 pozzetti, piastra singola o multipla)