1. Preparazione dei reagenti e dei materiali di partenza
- Preparazione di cellule MDCK e terreno di coltura cellulare sterile
- Coltivare cellule di rene canino Madin-Darby (MDCK) in terreno di Eagle modificato (MEM) integrato con il 10% di siero fetale di vitello inattivato a caldo (FCS) e antibiotici (100 unità/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina).
- Dopo lo scongelamento, far passare le cellule MDCK almeno 2 volte prima di infettarle per garantire il completo recupero (ma meno di 30 passaggi per evitare qualsiasi deriva nei fenotipi cellulari).
- Seminare 75 cm2 flaconi per colture tissutali contenenti 30 mL di 1x MEM sterile con 7,5 x 106 cellule MDCK e incubare a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO2.
- Preparazione di apparecchiature per il monitoraggio dell'impedenza
- Posizionare lo strumento nell'incubatrice a 35 °C e lasciarlo riscaldare per almeno 2 ore.
- Collegarlo alla centralina posta all'esterno dell'incubatrice.
- Procedere con le procedure di pulizia come raccomandato dal produttore prima di iniziare il resto dell'esperimento.
- Produzione di stock IAV su celle MDCK
- Per propagare e amplificare i virus H1N1, seminare 7,5 x 106 cellule MDCK su due fiasche di coltura tissutale da 75 cm2 e incubare per 24 ore a 37 °C per raggiungere il 90%-100% di confluenza.
- Decantare il terreno di coltura cellulare dal monostrato cellulare in fiasche da 75 cm2. Lavare le cellule con 5 mL di 1x PBS sterile.
- Rimuovere il PBS e aggiungere 5 ml di 1x PBS per lavare nuovamente le cellule.
- Etichettare un pallone come controllo e rimuovere il PBS prima di aggiungere 15 ml di terreno di propagazione del virus (1x MEM con 0% FCS) con cura sul monostrato. Incubare questo pallone in un incubatore mantenuto a 35 °C con CO2 al 5%. Usalo per il confronto dopo 3 giorni di propagazione.
- Scongelare un flaconcino di stock di IAV a RT. Diluire il virus alla concentrazione appropriata in una provetta da 1,5 mL contenente terreni di propagazione del virus (1x MEM con 0% di FCS).
- Rimuovere 1x PBS dal pallone da 75 cm2 e infettare le cellule MDCK con una molteplicità di infezione (MOI) di 1 x 10-3 o 1 x 10-4 unità formanti placche per cellula (pfu/cellula) aggiungendo 1 mL del virus diluito al monostrato cellulare.
- Assorbire il virus nelle cellule MDCK per 45 minuti a RT agitando regolarmente il pallone ogni 15 minuti.
- Rimuovere delicatamente l'inoculo e aggiungere 15 mL di terreno di propagazione virale per pallone contenente 1 μg/mL di TPCK-tripsina (tripsina/L-1-tosilamide-2-feniletilclorometlchetone), per scindere l'emoagglutinina virale HA0 nelle subunità HA1 e HA2 (un evento necessario per la fusione dell'HA con la membrana endosomiale e il rilascio del genoma virale).
- Incubare i palloni a 35 °C e 5% di CO2 per almeno 3 giorni per replicare il virus.
- Osservare le cellule MDCK al microscopio con un ingrandimento di 40x e cercare gli effetti citopatici (CPE) sulle cellule (confrontandole con il pallone di controllo cellulare). Se il CPE non è completo (cioè circa l'80% delle cellule si è staccato dal substrato), rimettere i matracci nell'incubatore per altre 24 ore.
- Al termine del CPE, decantare il surnatante della coltura cellulare e centrifugare a 300 x g per 10 minuti per pellettare i detriti cellulari.
- Trasferire il surnatante chiarificato in una provetta da 15 ml e aliquotare i virus della progenie in fiale criogeniche sterili monouso. Posizionare immediatamente le crioprovette a -80 °C per congelare e immagazzinare i virus.
- Infettare le cellule MDCK con diverse diluizioni di 10 volte di un titolo noto di 6 log10 TCID50/mL di virus H1N1, utilizzando il pipettaggio inverso per la riproducibilità seguendo i passaggi seguenti:
- Sciacquare le cellule MDCK 2 volte con 100 μL di MEM senza FCS (mezzi di propagazione del virus). Prestare attenzione a rimuovere tutti i terreni dopo il secondo lavaggio per evitare un'ulteriore diluizione dell'inoculo.
- Aggiungere 100 μl di sospensione virale in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta monocanale. Per evitare contaminazioni, procedere iniziando da sinistra a destra, quindi dall'alto verso il basso nella piastra, coprendo i pozzetti rimanenti con il coperchio.
- Inserire la piastra nella tasca della base dello strumento a 35 °C. Prestare attenzione per evitare movimenti improvvisi che potrebbero causare contaminazione.
- Iniziare a monitorare l'impedenza della cella ogni 15 minuti per almeno 100 ore come descritto al punto 2.10.
- Dopo i due cicli di misurazione (cioè 30 min), mettere in pausa l'apparecchio facendo clic su "Pausa" nella scheda "Esegui" e rimuovere la piastra E dalla base.
- Aggiungere 1 μg/mL di TPCK-tripsina al terreno di propagazione del virus per scindere l'emoagglutinina virale.
- Aggiungere 100 μL di terreno di propagazione del virus contenente TPCK-tripsina in ciascun pozzetto e inserire la piastra E nella tasca del cradle. 8. Fare clic su "Avvia/Continua" nella scheda "Esegui".
nota: Non dimenticare di creare un controllo negativo corrispondente alle cellule finte e infette sostituendo la sospensione virale con mezzi di propagazione del virus.
2. Cinetica di sopravvivenza IAV
- Esporre gli IAV ad acqua distillata salina a 35 °C e testarne l'infettività nel tempo misurando la diminuzione dell'impedenza cellulare.
- Preparare l'acqua distillata salina aggiungendo NaCl a una concentrazione finale di 35 g/L in acqua distillata. Aggiungere 900 μL di acqua salina in 2 mL di crioprovette.
- Aggiungere 100 μL di stock virale in acqua salina e posizionare le crioprovette in un incubatore (35 °C, 5% CO2) per 1 ora, 24 ore o 48 ore.
- Seminare 100 μl (contenenti 3 x 104) di cellule MDCK appena divise su una piastra per microtitolazione a 16 pozzetti e far crescere per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Infettare le cellule con 100 μL di virus esposti (precedentemente diluiti 10 volte in terreni di coltura) utilizzando il metodo di pipettaggio inverso per la riproducibilità ripetendo la sezione 1.4.
- Monitorare l'impedenza della cella ogni 15 minuti per almeno 100 ore.
