Dosaggio delle sostanze reattive all'acido tiobarbiturico per valutare lo stress ossidativo nel siero umano

Abstract

Fonte: Borges, C. R. et al., Valutazione dello stress ossidativo in campioni biologici utilizzando il saggio delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico. J. Vis. (2020)

Questo video mostra il test delle sostanze reattive all'acido tiobarbiturico (TBARS) per valutare lo stress ossidativo in campioni biologici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale

1. Saggio TBARS

NOTA: Una volta iniziato il test TBARS, dovrebbe essere terminato senza interruzioni.

1. Prelevare il maggior numero di campioni e standard centrifugati a 1500 x g per 10 min a 4 °C. Dopo la centrifugazione, conservare le provette di vetro contenenti i campioni e gli standard presso le provette di vetro RT. necessarie per il numero di campioni da analizzare ed etichettarle con i nomi dei campioni. Quindi, aggiungere 100 μl di ciascun campione preparato (lisati cellulari HepG2, lipoproteine a bassa densità, siero umano) in ciascuna provetta di vetro.
2. Aggiungere 200 μl di SDS all'8,1% a ciascun campione e standard e agitare delicatamente la provetta di vetro con un movimento circolare per miscelare il campione.
3. Aggiungere 1,5 mL del tampone acetato di sodio 3,5 M (pH = 4) a ciascun campione e standard.
4. Aggiungere 1,5 mL del tampone acetato di sodio 3,5 M (pH = 4) a ciascun campione e standard.
5. Portare il volume finale a 4 mL per ogni campione e standard aggiungendo 700 μL di acqua deionizzata.
6. Tappare ermeticamente ogni provetta di vetro e incubare in un blocco riscaldante impostato a 95 °C per 1 ora. Coprire le provette di vetro con un foglio di alluminio per evitare la condensa nella parte superiore delle provette.
7. Togliere i tubi di vetro dal blocco riscaldante e incubare con ghiaccio per 30 minuti.
8. Centrifugare campioni e standard a 1500 x g per 10 min a 4 °C. Dopo la centrifugazione, conservare le provette di vetro contenenti i campioni e gli standard a RT.
   nota: Mantenere i campioni sul ghiaccio o a 4 °C causerà la precipitazione dell'intero campione o dello standard.
9. Immediatamente dopo la centrifugazione, aliquotare 150 μl di surnatante da ciascuna provetta e collocarli in un pozzetto separato di una piastra a 96 pozzetti.
10. Rimuovere eventuali bolle da ogni pozzetto utilizzando una punta per pipetta.
    nota: La presenza di bolle produrrà letture di assorbanza incoerenti, portando a un'elevata imprecisione del saggio.
11. Leggere le assorbanze a 532 nm. Sottrarre la lettura media dell'assorbanza dei campioni bianchi da tutte le altre letture dell'assorbanza.
12. Crea una curva standard tracciando le letture dell'assorbanza sottratte in bianco a 532 nm rispetto alla concentrazione nota di ciascuno standard. Adattare i punti dati utilizzando la regressione lineare. Calcolare le concentrazioni di campioni sconosciute utilizzando l'equazione della retta di regressione lineare ottenuta dalla curva standard.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1x PBS sterile pH 7,4 1 L	VWR, PA	101642--262	Reagente per lisi cellulare
Provetta da centrifuga autoportante da 50 mL	Corning, NY	CLS430897	Materiale generale
Piastra a 96 pozzetti, Non trattata, trasparente, con coperchio, Non sterile	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	Per misurare l'assorbanza
Dispositivo filtrante centrifugo Amicon Ultra-0.5 100 kD	Fisher Scientific, NH	UFC510024	Purificazione LDL
Tappi per tubi di vetro	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	Per il test TBARS
Cloruro di rame II	SIGMA, MO	222011-250G	Per indurre l'ossidazione
Provette per coltura, monouso, con tappo a vite, vetro borosilicato (13 x 100 mm)	VWR, PA	Codice: 53283-800	Per il test TBARS
Mezzo essenziale minimo di Eagle (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	Terreni cellulari HepG2
Provette Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL	eppendorf, NY	22363204	Materiale generale
Provette Eppendorf Safe-Lock, 2,0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	Materiale generale
Siero fetale bovino Fonte statunitense	Omega Scientific, CA	FB-11	Per coltura cellulare
Acido acetico glaciale	SIGMA, MO	27225-1L-R	Reagente TBARS
Cocktail di inibitori della proteasi Halt (100x)	Thermo Scientific, MA	Codice 87786	Reagente per lisi cellulare
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	Solvente LDL
Acido cloridrico (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	Reagente per lisi cellulare
Centrifuga Legend Micro 17	Thermo Scientific, MA	75002431	Materiale generale
Lipoproteine a bassa densità, plasma umano	Atene Ricerca & Tecnologia, GA	16/12/120412	Prototipo di matrice biologica
Ancorette magnetiche, ottagono 6-assortimento	VWR, PA	Codice: 58948-025	Materiale generale
Malondialdeide bis (dimetilacetale)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standard
Spettrofotometro per micropiastre Multiskan Go	Fisher Scientific, NH	51119200	Per misurare l'assorbanza
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	Reagente per lisi cellulare
cloruro di sodio	SIGMA, MO	S7653-1KG	Reagente per lisi cellulare
Dodecil solfato di sodio (SDS)	SIGMA, MO	Codice 436143-100G	Reagente TBARS
idrossido di sodio	SIGMA, MO	367176-2.5KG	Reagente TBARS
Concentratore SpeedVac	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	Per la concentrazione di lisati cellulari
Acido tiobarbiturico	SIGMA, MO	T5500-100G	Reagente TBARS
Base TRIS	Fluka, GA	Codice 93362	Reagente per lisi cellulare