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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione
- Aggiungere 5 mL di Penicillina/Streptomicina (10000 U/mL) e 5 mL e 10 mL di integratori disponibili in commercio a 500 mL di terreno classico completo con siero. Aliquotare inizialmente 50 ml del terreno.
nota: Non rimettere alcun mezzo nel magazzino per evitare contaminazioni.
- Mettere un'aliquota dell'intero medium classico sul ghiaccio.
- Utilizzare etanolo al 70% per pulire il microscopio da dissezione, la pinza e le forbici.
- Preparare due piastre per colture cellulari (10 cm), una al microscopio da dissezione e una con ghiaccio; mettere 10 ml di terreno classico completo in ogni piatto.
2. Fasi sperimentali (Figura 1)
- Sacrificare i topi C57BL/6J intorno al postnatale (P) 20 utilizzando 75-100 mg/kg di ketamina e 7,5-10 mg/kg di xilazina iniettati per via intraperitoneale. Tenere gli occhi in completo medium classico sul ghiaccio prima della dissezione.
- Rimuovere il tessuto connettivo (muscolo e tessuto adiposo) e il nervo ottico dell'occhio.
- Utilizzare una microforbice per tagliare circonferenzialmente 0,5 mm posteriormente al limbus corneale. Rimuovere il complesso cornea/iride, il vitreo e il cristallino.
- Praticare un'incisione di 1 mm perpendicolare al bordo tagliato verso il nervo ottico e tagliare una banda circonferenziale di 1 mm di larghezza. Separare le regioni centrali e periferiche del complesso. Usa una pinza per staccare la retina dal complesso RPE/coroide/sclera.
- Mantenere la banda coroide periferica in completo mezzo classico sul ghiaccio; isolare l'altro occhio e ripetere il processo per tagliare una seconda fascia.
- Tagliare la fascia circolare in 6 pezzi quadrati ~uguali (~1 mm x 1 mm).
nota: Non toccare mai alcun bordo.
- Scongelare l'estratto della membrana basale (BME) secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 30 μL/pozzetto di BME al centro di ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Assicurarsi che la goccia di BME formi una cupola convessa nella parte inferiore della piastra senza toccare i bordi.
nota: Scongelare il BME per una notte in frigorifero. BME dovrebbe essere sul ghiaccio in qualsiasi momento dopo lo scongelamento.
- Posizionare il tessuto al centro del BME.
nota: Non appiattire l'espiantante di coroide; in generale, lascia che il tessuto si espanda all'interno del BME. L'orientamento del tessuto (lato sclerale verso l'alto o verso il basso) non influisce sul risultato sperimentale.
- Incubare la piastra a 37 °C per 10 minuti per far solidificare il gel.
- Aggiungere 500 μl del terreno/pozzetto classico completo.
- Cambiare il terreno classico a giorni alterni (500 μl). La germinazione delle coroidi può essere osservata dopo 3 giorni con un microscopio.
nota: Per il trattamento con fattore di crescita, affamare il tessuto per 4 ore. Diluire un composto di prova in un mezzo a ridotto contenuto di fattore di crescita (boost 1:200 invece di 1:50).
3. Metodo di quantificazione computerizzato SWIFT-Choroid (Figura 2)
NOTA: È stato utilizzato un metodo computerizzato per misurare l'area coperta dai vasi in crescita. Prima della quantificazione è necessario un plug-in macro per il software ImageJ.
- Apri l'immagine che germoglia la coroide con ImageJ e seleziona "Immagine |Tipo| 8 bit" con scala di grigi.
- Vai a "Immagine | Regola | Luminosità/Contrasto (Ctrl/shift/C)" e ottimizza il contrasto.
- Utilizzare la funzione bacchetta magica per delineare e rimuovere dall'immagine il tessuto coroide presente al centro dei germogli (utilizzando il tasto di scelta rapida "F1") (Figura 2A, B).
nota: Imposta il tasso di tolleranza della bacchetta magica al 20-30%.
- Rimuovere lo sfondo dell'immagine con gli strumenti di selezione gratuiti (Figura 2C). Vai a "Immagine | Regola | Soglia (Ctrl/Maiusc/T)". Utilizzare la funzione di soglia per definire i germogli microvascolari sullo sfondo e sulla periferia (Figura 2D).
- Fai clic su "F2" e apparirà un riepilogo. Salva un'immagine dell'area selezionata facendo clic su "Salva". Salvalo nella stessa cartella dell'immagine originale per riferimento futuro.
- Dopo aver misurato un gruppo di campioni, copiare il registrato per l'analisi dei dati.
nota: È anche possibile misurare l'area (μm²) con "Analizza | Imposta scala" utilizzando immagini con barre di scala.
