Saggio dell'attività del recettore degli estrogeni-reporter per lo screening dell'attività estrogenica dei fitoestrogeni

Abstract

Fonte: Fender, E. et al., Screening per i fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni basato su cellule β un saggio reporter. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive un test reporter basato su cellule per determinare l'attività estrogenica di composti di origine vegetale. Un composto con attività estrogeno-simile imita il suo legame con i recettori degli estrogeni e guida a valle la trascrizione genica dell'enzima reporter. L'enzima reporter genera bioluminescenza in una reazione, indicando l'attività estrogenica del composto.

Protocollo

1. Saggio di trasfezione del recettore umano degli estrogeni β

NOTA: Per il giorno 1 del protocollo di analisi sono necessari una tecnica asettica e una cappa a flusso laminare.

1. Preparare diluizioni di 17β-estradiolo per la curva standard.
   1. Trasferire il terreno di recupero cellulare e il mezzo di vagliatura composto (CSM) dal congelatore e scongelarli in un bagno d'acqua a 37 °C.
   2. Etichettare le provette per microcentrifuga Intermedio 1 e 2 (INT1, INT2) e 1-8.
   3. Riempire INT1 con 995 μL di CSM, INT2 con 615 μL di CSM, la provetta 1 con 900 μL di CSM e le provette 2-8 con 600 μL di CSM. Mettere da parte il tubo 8.
   4. Trasferire 5 μL di 100 μM di 17β-estradiolo in INT1. Scartare la punta. Vortice.
   5. Prima di ogni trasferimento, sciacquare la pipetta 3 volte, quindi trasferire 10 μl da INT1 a INT2. Scartare la punta.
   6. Sciacquare la pipetta 3 volte, quindi trasferire 100 μl da INT2 nella provetta 1. Scartare la punta. Trasferire 300 μl dalla provetta 1 alla provetta 2. Ripetere per i tubi da 3 a 7. Gettare 300 μl dalla provetta 7 nel contenitore dei rifiuti. Il tubo 8 è uno zero e non riceve estradiolo. Le concentrazioni finali degli standard placcati sono: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 e 0 pM di estradiolo.
2. Preparare i composti campione.
   1. Campioni di vortice.
   2. Prelevare 4 μl di ciascun campione di pianta in DMSO e aggiungerlo a 496 μl di CSM per ottenere una soluzione di DMSO allo 0,8%.
3. Scongelare rapidamente le cellule reporter.
   1. Recuperare la provetta del terreno di recupero cellulare dal bagno d'acqua a 37 °C. Disinfettare la superficie esterna con etanolo al 70%.
   2. Recupera le cellule reporter dalla conservazione a -80 °C e scongelale trasferendo 10 mL di CRM preriscaldato nella provetta di cellule congelate.
   3. Chiudere la provetta delle Cellule Reporter e trasferirle a bagnomaria a 37°C per 5-10 minuti.
   4. Recupera il tubo di Reporter Cell Suspension dal bagno d'acqua. Capovolgere delicatamente il tubo di cellule più volte per rompere gli aggregati di cellule e produrre una sospensione omogenea. Pulire la superficie del tubo con etanolo al 70%.
4. Piastra di saggio.
   1. Erogare 100 μl di sospensione di cellule reporter in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale.
   2. Erogare 100 μl di campioni in triplicato in pozzetti di saggio appropriati.
   3. Trasferire la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C con CO₂ al 5% per 22-24 ore.
5. Scongelare il substrato di rilevamento e il tampone di rilevamento in un frigorifero buio durante la notte per prepararsi al giorno 2.
6. Poco prima della fine dell'incubazione della piastra, rimuovere il substrato di rilevamento e il tampone di rilevamento dal frigorifero e collocarli in un'area con scarsa illuminazione fino a quando non si sono bilanciati a RT. Una volta a RT, capovolgere delicatamente ogni provetta più volte per mescolare accuratamente le soluzioni.
   1. Immediatamente prima del completamento dell'incubazione, versare l'intero contenuto del tampone di rilevamento nella provetta del substrato di rilevamento per creare il reagente di rilevamento della luciferasi. Mescolare delicatamente in modo da non produrre schiuma.
   2. Una volta completata l'incubazione, capovolgere la piastra per scartare il contenuto in un contenitore per rifiuti appropriato. Picchiettare delicatamente la piastra su un tovagliolo di carta assorbente pulito per rimuovere le ultime goccioline dai pozzetti.
   3. Aggiungere 100 μl di reagente per la rilevazione della luciferasi a ciascun pozzetto. Lasciare riposare la piastra del saggio a RT per 15 minuti. Non scuotere la piastra.
7. Quantifica la luminescenza utilizzando un luminometro a 96 pozzetti con lettura a piastra.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pipetta da 1000 μl
Pipetta da 20 μl
Pipetta da 200 μl
Bagnomaria a 37 °C
37 °C, umidificato al 5% di CO2
70% etanolo
Bilancia analitica
Cappa a flusso laminare per colture cellulari
Dimetilsolfossido
Bacinella per terreni monouso, sterile
Sistema di filtrazione a goccia
Palloni di Erlenmeyer			125 mL e 250 mL
Metanolo di grado HPLC
Sistema di saggi reporter ERβ umano, 1 x 96 saggi a pozzetti	Indigo Bioscienze	IB00411	Kit di analisi - analizza 24 campioni più la curva standard
Liofilizzante
Pipetta multicanale
Agitatore orbitale
Luminometro a lettura di targhe			es. Bioteck Synergy HTX
Evaporatore rotante
Palloni a fondo tondo			50 mL e 300 mL
Provette sterili per microcentrifuga o vasche sterili per terreni multicanale
Puntali sterili			200 μl e 1000 μl
Elaborato Whatman grado 1
Borse whirl-pak			Sacchetti sterili in polietilene