Trasferimento di energia per risonanza di Forster risolta nel tempo per il monitoraggio della fosforilazione delle proteine nelle cellule

Abstract

Fonte: Padros, J. et al., Saggi di trasferimento di energia di risonanza di Förster risolti nel tempo per la misurazione delle proteine STAT fosforilate endogene nelle cellule umane. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive il trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo o il saggio TR-FRET per determinare la fosforilazione endogena delle proteine con l'aiuto di fluorofori donatori e accettori marcati su anticorpi specifici per una proteina in esame. Questa tecnica è progettata per misurare la fosforilazione delle proteine in esame nei lisati cellulari.

Protocollo

1. Coltura cellulare

1. Mantenere le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C/5% di CO₂ e coltura con DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (cellule HeLa e A431) o RPMI integrato con il 15% di FBS (cellule U266B1). Coltivare le cellule fino a raggiungere il 70-80% di confluenza, quindi tripnizzarle e passarle o utilizzarle per i saggi.
   nota: I terreni di coltura contenevano rosso fenolo. Prima di condurre i saggi, non è stata condotta alcuna carenza di siero per nessuna linea cellulare.

2. Titolazione dello stimolatore o dell'inibitore utilizzando il protocollo di analisi....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Micropiastra a 96 pozzetti, trasparente, fondo piatto, polistirene, trattamento per coltura tissutale, sterile	Corning	3595	Questa è la piastra per la coltura delle cellule quando si utilizza il protocollo di analisi a due piastre. Possono essere utilizzate altre piastre a 96 pozzetti per colture cellulari
Micropiastra a 384 pozzetti, bianca, a basso volume	PerkinElmer	6007290	Questa è la piastra per il rilevamento TR-FRET quando si utilizzano i protocolli di analisi a due o una piastra. È possibile utilizzare altre piastre bianche a 384 pozzetti a basso volume
Linea cellulare A431	ATCC	CRL-1555
Guarnizione adesiva per micropiastre	PerkinElmer	6050185
Eagle medium modificato di Dulbecco (DMEM)	bisonte europeo	319-005-CL	THUNDER TR-FRET è compatibile con terreni di coltura contenenti rosso fenolo
Lettore di targhe multietichetta EnVision Xcite	PerkinElmer	Codice 2104-0020A	I saggi possono essere eseguiti su una varietà di lettori di piastre dotati dell'opzione TR-FRET
Linea cellulare HeLa	ATCC	CCL-2
Roswell Park Memorial Institute 1640 medio (RPMI)	bisonte europeo	350-007-CL	THUNDER TR-FRET è compatibile con terreni di coltura contenenti rosso fenolo
Tripsina/EDTA 0,05%	bisonte europeo	325-542-CL
Acqua ultrapura	Na	Na	Utilizzare acqua di grado Milli-Q (18 MΩ.cm) per diluire il tampone di lisi e il tampone di rilevamento