Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale
1. Isolamento e coltura di cellule progenitrici neurali umane (hNPC)
- Posizionare il tessuto cerebrale in una capsula di Petri da 100 mm e rimuovere con cura le meningi utilizzando una pinza.
- Trasferire il tessuto cerebrale in una provetta conica da 50 ml e lavarla due volte con 20 ml di PBS capovolgendo delicatamente la provetta.
- Incubare il tessuto cerebrale in una nuova provetta conica da 50 mL immergendo il tessuto in una soluzione di dissociazione cellulare (vedere la Tabella dei materiali) e DNasi I (10 U/mL) per 10 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 5 mL di terreno di coltura cellulare neuronale (vedere Tabella dei materiali) al tubo contenente tessuto cerebrale e dissociare meccanicamente le neurosfere triturando da 20 a 30 volte attraverso un puntale di pipetta da 1000 μL per ottenere una sospensione a singola cellula.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere i cluster cellulari.
- Seminare la sospensione a singola cellula in un pallone di T-25 ventilato con 5-10 mL di terreno di coltura cellulare neuronale integrato con i componenti descritti nella Tabella 1.
- Sterilizzare la soluzione di eparina mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,2 μm. L'integratore B-27 senza Vitamina A è un integratore senza siero per la coltivazione di progenitori neurali e cellule staminali senza indurre differenziazione.
nota: Le cellule progenitrici neurali umane (hNPC) sono isolate da un cervello fetale umano raccolto da un feto abortito. Dopo 7-10 giorni di coltura, le cellule staminali neurali (NSC) formano colonie di neurosfere fluttuanti, mentre altri tipi di cellule rimangono in sospensione come cellule singole o si attaccano al fondo del pallone. Le hNPC isolate possono essere coltivate come neurosfere in sospensione per diversi mesi.
2. Passare gli hNPC
- Raccogliere il terreno contenente le sfere galleggianti, le neurosfere grandi e piccole, e trasferirle in una provetta conica da 50 mL.
nota: Per ragioni sconosciute, i tempi per la scissione delle neurosfere sono variabili da 7 giorni fino a 30 giorni. Tuttavia, generalmente, le neurosfere devono essere attraversate quando raggiungono un diametro maggiore di 700-900 μm. Questo è quando il centro della neurosfera inizia a scurirsi, il che è considerato un segno di un alto tasso di morte cellulare.
- Far girare le neurosfere verso il basso mediante centrifugazione a 300-400 x g per 3 minuti.
- Aspirare con cautela il surnatante e quindi immergere le sfere in 500 μl di reagente di dissociazione cellulare scongelato (vedere la tabella dei materiali).
- Produrre aliquote di reagente di dissociazione cellulare aggiungendo 500 μl per microprovette da 1,5 mL e conservare a -20 °C. Per evitare di perdere l'attività enzimatica, scongelare il reagente di dissociazione cellulare tenendolo a RT o riscaldandolo per 5 minuti in un bagno d'acqua/microsfere a 37 °C.
- A seconda della densità e delle dimensioni delle sfere, incubare le sfere sommerse a 37 °C per 5-15 minuti.
- Aggiungere 5-10 mL di terreno di coltura preriscaldato alle neurosfere contenenti provetta conica da 50 mL e centrifugare a 300-400 x g per 5 minuti per sedimentare le neurosfere.
- Aspirare il surnatante e pipettare delicatamente su e giù, utilizzando una pipetta da 1000 μl, in 2 mL di terreno di coltura fino a quando tutte le neurosfere sono in una sospensione unicellulare.
nota: La dissociazione diventerà visibile ad occhio nudo. Prima della dissociazione, le neurosfere hanno la forma di sfere. Dopo l'immersione nel reagente di dissociazione e il pipettaggio su e giù, diventeranno cellule singole.
- Contare e colorare le singole cellule, da 2 a 3 milioni di cellule per matraccio T-25, in 10 mL di terreno di coltura.
- Nutrire le cellule ogni 3 giorni sostituendo metà del terreno di coltura.
- Sistemare le neurosfere appoggiando la fiaschetta in modo che si trovi nell'angolo inferiore. Tenere il pallone in posizione per circa 1-2 minuti fino a quando le neurosfere non si sedimentano. Quindi aspirare delicatamente metà del terreno inserendo la pipetta sierologica nel terreno sopra le neurosfere stabilizzate. Le cellule dissociate possono aggregarsi per formare sfere dopo 2 o 3 giorni di coltura.
3. Congelare gli hNPC
- Preparare il terreno di congelamento cellulare aggiungendo DMSO al terreno di coltura a una concentrazione finale del 10% (v/v) o utilizzare un terreno di crioconservazione disponibile in commercio per tipi di cellule sensibili (vedere la Tabella dei materiali).
- Separare le sfere di grandi dimensioni trasferendo il terreno in una provetta conica da 50 ml e lasciando che le sfere si depositino per gravità. Quindi rimuovere e trasferire le grandi neurosfere in una nuova provetta conica da 50 mL per il passaggio utilizzando un puntale per pipetta da 200 o 1000 μL.
nota: Le neurosfere con un diametro superiore a 900 μm sono considerate grandi e quelle con un diametro inferiore a 500 μm sono considerate piccole.
- Centrifugare le neurosfere rimanenti mediante centrifugazione a 300-400 x g per 3 minuti. Rimuovere con cautela il surnatante.
- Risospendere fino a 100 sfere in 1 mL di reagente per crioconservazione e trasferirlo in una crioprovetta.
- Conservare per una notte a -80 °C in un contenitore per il congelamento delle cellule (vedi Tabella dei materiali) e trasferirlo in azoto liquido il giorno successivo per la conservazione a lungo termine.
nota: È preferibile congelare neurosfere di piccole e medie dimensioni (di diametro inferiore a 900 μm) ed evitare di congelare neurosfere di grandi dimensioni (di diametro superiore a 900 μm) o singole cellule. Al fine di ridurre i danni cellulari durante lo scongelamento del campione, mantenere le cellule dense seminando le neurosfere scongelate in una piccola fiaschetta T25.
4. Valutazione della neurotossicità
NOTA: La citotossicità dei composti in esame viene valutata in piastre da 384 pozzetti (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un saggio di vitalità cellulare luminescente (vedi Tabella dei materiali). Le hNPCs sono preparate seguendo lo stesso metodo, ad eccezione di lievi modifiche, descritte nella sezione "Differenziazione e trattamento delle hNPCs". Successivamente, un segnale luminescente generato dal saggio di vitalità delle cellule luminescenti viene misurato utilizzando un lettore di micropiastre. Il segnale luminescente è proporzionale alla concentrazione cellulare di ATP, che a sua volta è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali presenti in ciascun pozzetto.
- rivestimento
- Aggiungere 30 μl di poli-L-lisina (PLL) per pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.
- Incubare per 1 ora a RT.
- Lavare 2 volte con PBS.
- Lasciate asciugare a RT (per circa 30 min).
- Aggiungere 30 μL di laminina (50 μg/mL) per pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.
- Incubare per 2 ore a 37 °C.
- Lavare 2 volte con PBS.
nota: Le piastre rivestite a 384 pozzetti possono essere conservate a 4 °C per 1 mese.
- Placcatura delle celle
- Contare e piastra 20.000 neurosfere unicellulari per pozzetto di una piastra da 384 pozzetti in 25 μL di terreno di differenziazione.
- Incubare per 5 giorni a 37 °C.
- Dopo 5 giorni, trattare le cellule per 24 ore con composti di prova preparati a 6 volte la concentrazione finale desiderata in 5 μl di volume (per ottenere il volume finale di 30 μl per pozzetto).
- Saggio di vitalità cellulare
- Aggiungere 30 μl di reagente per il saggio di vitalità cellulare luminescente per pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.
nota: Aggiungere un volume di reagente per il saggio di vitalità cellulare luminescente uguale al volume presente in ciascun pozzetto. Scongelare il reagente del saggio di vitalità cellulare luminescente e bilanciarlo in RT prima dell'uso.
- Agitare su uno shaker per 2 minuti (per mescolare e indurre la lisi cellulare).
- Centrifugare la miscela per centrifugazione a 300-400 x g per 30 s.
- Incubare la piastra a 384 pozzetti per 10 minuti a RT in un luogo protetto dalla luce (per stabilizzare il segnale luminescente).
- Registra la luminescenza con un lettore di micropiastre.
nota: Utilizzare controlli appropriati per il test di vitalità, includendo Velcade (a una concentrazione finale di 10 μM) come positivo e HBSS contenente DMSO (con una concentrazione finale dello 0,1% o 0,2%) come controllo negativo.
Tabella 1. Componenti necessari per produrre 100 ml di terreno di coltura
| importo | componente |
| 100 μl | EGF (20 ng/mL) |
| 100 μl | FGF (10 ng/mL) |
| 2 ml | B-27, Meno vitamina A (50X) |
| 1 ml | L-alanil-L-glutammina (100X) (vedi tabella dei materiali) |
| 4 μl | Eparina (2 μg/mL) |
| 96,8 ml | Terreno di coltura cellulare neuronale (vedi tabella dei materiali) |
