Nessun conflitto di interessi dichiarato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vetrini di copertura circolari da 18 mm</td>
			<td>Termo Scientifico</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilizzare prima dell'uso</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citocalasina D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolto in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi kit plasmidico EndoFree</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>Codice 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mezzo di montaggio a fluorescenza</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldeide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Si prega di consultare i riferimenti 8 e 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresse PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillina-Streptomicina</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromidrato di poli-D-lisina</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatola</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saggio di immunofluorescenza per valutare l'effetto delle proteine bersaglio sulla crescita dei neuriti

Fonte: Chan, W., W., R. et al. <a href="https://app.jove.com/v/60031">Un test potenziato basato sulla proteina a fluorescenza verde per lo studio della crescita della neurite nei neuroni primari.</a> J. Vis. Exp. (2019).
In questo video, dimostriamo un test di immunofluorescenza basato su EGFP per identificare l'efficacia delle proteine bersaglio sulla crescita neuritica dei neuroni corticali primari. I neuroni primari vengono trasfettati con una proteina fluorescente, EGFP, e una proteina bersaglio, quindi viene eseguito un test immunologico per studiare l'effetto della proteina bersaglio sulla crescita dei neuriti.

Saggio di immunofluorescenza per valutare l'effetto delle proteine bersaglio sulla crescita dei neuriti

Fonte: Chan, W., W., R. et al. Un saggio potenziato basato sulla proteina a fluorescenza verde per lo studio della crescita dei neuriti nei neuroni primari. J. Vis. Exp. 
...

I neuroni in via di sviluppo estendono i processi citoplasmatici dai loro corpi cellulari attraverso la crescita dei neuriti per sviluppare dendriti e assoni, che sono essenziali per la comunicazione da neurone a neurone.
Per studiare l'effetto di una proteina bersaglio sulla crescita dei neuriti, prendere una piastra multipozzetto con un vetrino coprioggetti rivestito di poli-D-lisina alla base. La superficie del vetrino coprioggetti ha una coltura aderente di neuroni corticali primari derivati dal cervello embrionale di ratto.
Trattare i neuroni con una miscela contenente due tipi di plasmidi: un plasmide EGFP che codifica per la proteina fluorescente verde potenziata e un secondo plasmide che codifica per la proteina bersaglio in un reagente di trasfezione adatto.
Il reagente di trasfezione facilita l'ingresso dei plasmidi nelle cellule.
Dopo la trasfezione, entrambi i plasmidi vengono espressi, producendo proteine fluorescenti verdi e proteine bersaglio. L'espressione di EGFP conferisce fluorescenza verde alle cellule co-trasfettate.
Le proteine bersaglio con potenziale stimolante la crescita dei neuriti avviano la segnalazione cellulare, che promuove la riorganizzazione del citoscheletro e porta allo sviluppo di proiezioni neuronali e delle loro estensioni.
Aspirare il terreno esaurito e fissare le cellule con paraformaldeide. Controcolorare le cellule utilizzando anticorpi proteici anti-bersaglio marcati con fluorescenza rossa che legano specificamente le proteine bersaglio espresse e impartiscono ulteriore fluorescenza rossa alle cellule.
Rimuovere il vetrino coprioggetti dalla piastra di coltura e osservarlo al microscopio a fluorescenza.
Le cellule co-trasfettate che mostrano un segnale di fluorescenza bicolore mostrano processi neuronali più lunghi rispetto alle cellule prive di fluorescenza rossa, confermando l'effetto stimolante della proteina bersaglio sulla crescita dei neuriti.

Dopo due giorni a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, diluire l'EGFP e il DNA del plasmidi proteici bersaglio e il reagente di trasfezione in due provette separate da 1,5 millilitri, quindi mescolarli insieme. Trasfettare le cellule con il costrutto EGFP aggiungendo la miscela di trasfezione ai pozzetti.
Dopo 24 ore, lavare le celle con PBS a 37 gradi Celsius e fissarle con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, lavare le cellule fissate tre volte con PBS fresco per lavaggio e aggiungere un volume minimo di terreno di montaggio a fluorescenza su un vetrino per microscopio, per campione. Quindi, trasferire con cura i vetrini coprioggetti rivestiti sul supporto di montaggio, con i campioni rivolti verso i vetrini.
Per visualizzare la crescita dei neuriti, selezionare l'obiettivo 40x su un microscopio a epifluorescenza e fare clic su "Avvia" per acquisire immagini da almeno 40 neuroni EGFP-positivi intatti per trasfezione.
Quando tutti i nuovi diritti sono stati acquisiti, apri le immagini acquisite in ImageJ con il plug-in NeuronJ e misura la lunghezza del neurite più lungo di ciascun neurone dal corpo cellulare alla punta del cono di crescita. Quindi, analizza i dati ottenuti con il software, per determinare l'effetto delle proteine bersaglio sulla crescita dei neuriti.

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Saggio di immunofluorescenza per valutare l'effetto delle proteine bersaglio sulla crescita dei neuriti

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Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini di copertura circolari da 18 mm	Termo Scientifico	CB00180RA	Sterilizzare prima dell'uso
Citocalasina D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolto in DMSO
Maxi kit plasmidico EndoFree	QIAGEN	Codice 12362
Mezzo di montaggio a fluorescenza	Dako	S302380
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Si prega di consultare i riferimenti 8 e 15
Compresse PBS	Gibco	18912014
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122
Bromidrato di poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P7280
spatola	Sigma-Aldrich	S4147
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	Gibco	25300062