Saggio di complementazione della luciferasi divisa per identificare specifiche interazioni proteina-proteina

Abstract

Fonte: Wiertelak, W. et.al., Dimostrazione di complessi eterologhi formati da proteine di membrana di tipo III residenti nel Golgi utilizzando il saggio di complementazione della luciferasi divisa. (2020)

Questo video mostra il test di complementazione della luciferasi divisa per rilevare le interazioni proteina-proteina. In questo saggio, le proteine di interesse sono etichettate con frammenti piccoli e grandi dell'enzima luciferasi. Quando le proteine interagiscono, i frammenti grandi e piccoli si combinano per formare un complesso enzimatico attivo, che in presenza di un substrato specifico, rilascia una luminescenza brillante che può essere misurata.

Protocol

1. Trasfezione transitoria dei plasmidi di espressione nelle cellule

1. Raccogliere l'aderente HEK293T coltura cellulare mediante tripsinizzazione e risospendere le cellule in un terreno di crescita completo dedicato. Piastra le celle (2 x 10⁴/100 μL/pozzetto) su una piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente e lato bianco. Regolare il numero totale di pozzetti per adattarsi a tutte le combinazioni e i controlli testati, comprese le repliche.
   nota: Tentare di utilizzare solo i 60 pozzetti interni della piastra per ridurre al minimo gli sbalzi termici ed evitare l'evaporazione notturna. Si consiglia vivamente l'utilizzo di piastre rivestite in poli-D-lisina come quelle indicate nella Tabella dei Materiali, altrimenti le celle potrebbero staccarsi durante le successive fasi di lavaggio.
2. Coltura delle cellule per una notte in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂).
3. Il giorno successivo trasfettare le cellule con le combinazioni desiderate di plasmidi di espressione.
   1. Diluire i plasmidi di espressione in un terreno privo di siero (vedi Tabella dei materiali) a 6,25 ng/μL per ciascun costrutto.
   2. Aggiungere il reagente di trasfezione a base lipidica a un rapporto lipidi/DNA appropriato e incubare secondo le istruzioni del produttore.
   3. Aggiungere 8 μL di miscela di lipidi: DNA ai pozzetti designati. Mescolare il contenuto della piastra ruotando delicatamente. Ciò si traduce nella trasfezione di entrambi i costrutti di espressione a 50 ng/pozzo.
4. Coltura delle cellule per 20-24 ore in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂).
   nota: La coltura delle cellule per un tempo più lungo può portare a livelli più elevati di espressione della proteina di fusione, che può promuovere un'associazione non specifica tra i frammenti.

2. Scambio medio

1. Il giorno successivo sostituire il terreno condizionato con 100 μl di un terreno privo di siero in ciascun pozzetto. Assicurarsi che le celle non si siano staccate durante lo scambio del mezzo.
   nota: Questo passaggio deve essere eseguito 2-3 ore prima dell'aggiunta della soluzione di lavoro della furimazina. La sospensione del siero riduce al minimo lo sfondo causato dall'autoluminescenza della furimazina.

3. Preparazione della soluzione di lavoro della furimazina

1. Poco prima della misurazione, mescolare 1 volume di furimazina con 19 volumi di un tampone di diluizione (una diluizione di 20 volte).
   nota: Il volume totale della soluzione di lavoro della furimazina da preparare dipende dal numero di singoli pozzetti da analizzare (la soluzione di lavoro della furimazina viene aggiunta al terreno di coltura cellulare in un rapporto 1:5, pertanto, a ciascun pozzetto precedentemente riempito con 100 μL di un terreno privo di siero devono essere aggiunti 25 μL della soluzione di lavoro della furimazina).
2. Aggiungere la soluzione di lavoro della furimazina nei pozzetti designati (25 μL/pozzetto). Mescolare delicatamente la piastra a mano o utilizzando uno shaker orbitale (ad es. 15 s a 300-500 giri/min).

4. Misurazione della luminescenza

1. Inserire la piastra in un lettore di micropiastre a luminescenza.
   1. Per gli esperimenti che devono essere eseguiti a 37 °C, equilibrare la piastra per 10-15 minuti alla temperatura indicata.
2. Selezionare i pozzetti da analizzare.
3. Leggere la luminescenza con un tempo di integrazione di 0,3 s. Continuare a monitorare la luminescenza per un massimo di 2 ore quando necessario.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%			Coltura cellulare
Linea cellulare di mammifero aderente			Coltura cellulare
BioCoat Poly-D-Lysine 96 pozzetti a fondo piatto bianco/trasparente Micropiastra trattata TC, con coperchio	Corning	356651	Articoli in plastica
Centrifuga per coltura cellulare			Articoli in plastica
Integratori per colture cellulari (siero fetale bovino inattivato termicamente, L-glutammina, penicillina, streptomicina)			Coltura cellulare
Incubatore a CO2			dispositivo
Plasmidi di espressione che codificano per una o più proteine di interesse non marcati con frammenti di NanoBiT			Saggio
Reagente di trasfezione FuGENE HD	Promega	E2311	Saggio
Lettore di micropiastre GloMax Discover (o un lettore di micropiastre a luminescenza diverso)	Promega	GM3000	dispositivo
Terreno di crescita dedicato alla linea cellulare utilizzata			Coltura cellulare
Materiali e reagenti per il clonaggio molecolare standard (batteri, polimerasi termostabile, enzimi di restrizione, DNA ligasi, materiali e reagenti per la purificazione degli acidi nucleici)			Saggio
Sistema di avviamento NanoBiT MCS	Promega	N2014	Questo kit contiene vettori che consentono di marcare le proteine di interesse con frammenti di NanoBiT a diversi orientamenti, nonché il plasmide di controllo che codifica per la proteina HaloTag fusa con SmBiT e una coppia di plasmidi di controllo positivo.
Sistema di analisi su cellule vive Nano-Glo	Promega	N2011	Questo kit contiene furimazina, che è un substrato che consente il rilevamento dell'attività di NanoLuc nelle cellule viventi, e un tampone di diluizione dedicato.
Opti-MEM I Siero Ridotto Medium, senza rosso fenolo	Gibco	11058021	Coltura cellulare
Agitatore orbitale			dispositivo