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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE
1. Protocollo MeCP2-ECLIA
- Preparazione della soluzione di lavaggio, del tampone bloccante e della soluzione diluente per il saggio (giorno 1)
- Aggiungere 500 μL di Tween 20 a 1 L di PBS per preparare una soluzione Tween 20 in PBS allo 0,05%, mescolare energicamente ed etichettare come "soluzione di lavaggio".
nota: Assicurarsi che venga utilizzato solo il tampone di lavaggio appena preparato.
- Preparare una soluzione bloccante del bloccante A al 3% (Tabella dei materiali) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mescolate mescolando delicatamente, filtrate, sterilizzate e conservate in frigo fino all'uso per un massimo di due settimane.
- Aggiungere 5 mL di soluzione bloccante a 10 mL di PBS per preparare la soluzione diluente del saggio (bloccante A all'1% in PBS).
- Rivestimento di piastre ad alta legatura
- Estrarre una piastra ad alto legame a punto singolo multi-array a 96 pozzetti.
nota: Le piastre ad alto legame hanno una maggiore capacità di legatura e quindi una gamma dinamica più ampia rispetto alle piastre standard con superfici idrofobiche.
- Scongelare l'anticorpo monoclonale di topo anti-MeCP2 su ghiaccio e mescolare 0,67 μL di anticorpo con 4 mL di PBS (diluizione 1:6.000 di anticorpi in PBS). Agitare la soluzione anticorpale per miscelarla bene ed etichettare la provetta come "soluzione di rivestimento".
- Erogare con cautela 25 μL di soluzione di rivestimento nell'angolo inferiore di ciascun pozzetto utilizzando un pipettatore multicanale; questo è chiamato metodo di rivestimento in soluzione. Picchiettare delicatamente la piastra a 96 pozzetti su ciascun lato per assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra il fondo di ciascun pozzetto.
- Sigillare la piastra con un foglio adesivo e incubare la piastra in frigorifero a 4 °C per una notte (12-16 h).
- Blocco (giorno 2)
- Togliete il piatto dal frigo e togliete la pellicola.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento dell'anticorpo gettandola nel cestello dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione di rivestimento dai pozzetti.
- Aggiungere 125 μl di soluzione bloccante per pozzetto. Sigillare nuovamente la piastra e posizionarla su uno shaker orbitale per micropiastre.
- Incubare la piastra per 90 minuti a temperatura ambiente agitando costantemente a 800 giri/min.
- Preparazione di norme e campioni
- Durante il periodo di incubazione, preparare gli standard proteici MeCP2 e/o TAT-MeCP2 e vari campioni.
nota: Il tampone di lisi utilizzato per la diluizione standard deve essere lo stesso utilizzato nei campioni analizzati.
- Prelevare una fiala di soluzione madre proteica MePC2 e/o TAT-MeCP2 (250 μg/mL), lisati cerebrali di topo e lisati HDF a partire da -80 °C. Scongelarli con ghiaccio.
- Diluire la soluzione madre standard (MeCP2 e/o TAT-MeCP2) in provette pulite secondo la Tabella 1.
- Diluire i campioni nel tampone di lisi come segue: 1-20 μg di lisato cerebrale di topo per 25 μL di tampone di lisi e 0,25-1 μg di lisato HDF per 25 μL di tampone di lisi. Preparare un volume sufficiente di ciascun campione per eseguire l'analisi in triplice copia.
- Aggiunta dei campioni e delle soluzioni standard
- Rimuovere la soluzione bloccante infilandola nel cestino dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione bloccante dai pozzetti.
- Lavare la piastra 3 volte con 150 μL di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
- Aggiungere 25 ul di standard e campioni nell'angolo inferiore del pozzetto utilizzando una pipetta monocanale.
- Sigillare la piastra e incubare la piastra per 4 ore a temperatura ambiente agitando costantemente a 800 giri/min.
- Anticorpo di rilevamento non marcato
- Scongelare l'anticorpo policlonale anti-MeCP2 del coniglio con ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:6.000 in soluzione di diluente per il saggio.
- Rimuovere gli standard e i campioni gettandoli nel cestino dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta.
- Lavare la piastra 3 volte con 150 μL di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
- Aggiungere 25 μl di anticorpo di rilevamento non marcato a ciascun pozzetto con il pipettatore multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per 1 ora agitando costantemente a 800 giri/min a temperatura ambiente.
- Anticorpo coniugato specifico
- Estrarre l'anticorpo secondario specifico (Tabella dei materiali) dal frigorifero e metterlo sul ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:666.67 in soluzione di diluente per il saggio e mescolare delicatamente.
- Rimuovere l'anticorpo secondario libero non etichettato gettandolo nel cestino dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta.
- Lavare la piastra 3 volte con 150 μL di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
- Aggiungere 25 μl di anticorpo coniugato specifico (Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto con il pipettatore multicanale. Sigillare la piastra e incubare per 1 ora agitando costantemente a 800 giri/min a temperatura ambiente.
- Lettura della targa
- Rimuovere l'anticorpo coniugato libero (Tabella dei materiali) gettandolo nel cestino dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta.
- Lavare la piastra 3 volte con 150 μL di soluzione di lavaggio.
- Aggiungere alla piastra 150 μl di tampone di lettura in oro a base di Tris 1x (tabella dei materiali) con tensioattivo contenente tripropilammina come co-reagente per la generazione di luce. Evitare la formazione di bolle d'aria utilizzando tecniche di pipettaggio inverso.
- Posizionare la piastra sulla piattaforma di rilevamento della micropiastra (Tabella dei materiali) e avviare immediatamente la misurazione. Utilizzare le impostazioni per l'acquisizione di piastre a 96 pozzetti.
- Cattura i segnali di elettrochemiluminescenza da una telecamera CCD integrata in un sistema di rilevamento dell'elettrochemiluminescenza (Tabella dei materiali) e registra i conteggi dei segnali, che corrispondono alle unità di luce relativa (RLU) e sono direttamente proporzionali all'intensità della luce.
nota: Dopo stimolazione elettrochimica, l'etichetta di rutenio legata all'elettrodo di carbonio emette luce di luminescenza a 620 nm. Analizza i dati con il software fornito con lo strumento (Tabella dei materiali).
Tabella 1: Serie standard da 0 a 1.800 ng/mL.
| standard | concentrazione | diluizione |
| Norma 1 | 1.800 ng/mL | 1,08 μL di soluzione madre standard + 148,92 μL di tampone di lisi |
| Norma 2 | 600 ng/mL | 50 μL Standard 1 + 100 μL Tampone di lisi |
| Standard 3 | 200 ng/mL | 50 μL Standard 2 + 100 μL Tampone di lisi |
| Norma 4 | 66,67 ng/mL | 50 μL Standard 3 + 100 μL Tampone di lisi |
| Norma 5 | 22,22 ng/mL | 50 μL Standard 4 + 100 μL Tampone di lisi |
| Standard 6 | 7,41 ng/mL | 50 μL Standard 5 + 100 μL Tampone di lisi |
| Norma 7 | 2,47 ng/mL | 50 μL Standard 6 + 100 μL Tampone di lisi |
| Standard 8 | 0,82 ng/mL | 50 μL Standard 7 + 100 μL Tampone di lisi |
| Standard 9 | 0,27 ng/mL | 50 μL Standard 8 + 100 μL Tampone di lisi |
| Standard 10 | 0 ng/mL | 150 μl di tampone di lisi |