Saggio di elettrochemiluminescenza per la quantificazione dei livelli di proteine bersaglio nel lisato cerebrale

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE

1. Protocollo MeCP2-ECLIA

1. Preparazione della soluzione di lavaggio, del tampone bloccante e della soluzione diluente per il saggio (giorno 1)
   1. Aggiungere 500 μL di Tween 20 a 1 L di PBS per preparare una soluzione Tween 20 in PBS allo 0,05%, mescolare energicamente ed etichettare come "soluzione di lavaggio".
      nota: Assicurarsi che venga utilizzato solo il tampone di lavaggio appena preparato.
   2. Preparare una soluzione bloccante del bloccante A al 3% (Tabella dei materiali) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mescolate mescolando delicatamente, filtrate, sterilizzate e conservate in frigo fino all'uso per un massimo di due settimane.
   3. Aggiungere 5 mL di soluzione bloccante a 10 mL di PBS per preparare la soluzione diluente del saggio (bloccante A all'1% in PBS).
2. Rivestimento di piastre ad alta legatura
   1. Estrarre una piastra ad alto legame a punto singolo multi-array a 96 pozzetti.
      nota: Le piastre ad alto legame hanno una maggiore capacità di legatura e quindi una gamma dinamica più ampia rispetto alle piastre standard con superfici idrofobiche.
   2. Scongelare l'anticorpo monoclonale di topo anti-MeCP2 su ghiaccio e mescolare 0,67 μL di anticorpo con 4 mL di PBS (diluizione 1:6.000 di anticorpi in PBS). Agitare la soluzione anticorpale per miscelarla bene ed etichettare la provetta come "soluzione di rivestimento".
   3. Erogare con cautela 25 μL di soluzione di rivestimento nell'angolo inferiore di ciascun pozzetto utilizzando un pipettatore multicanale; questo è chiamato metodo di rivestimento in soluzione. Picchiettare delicatamente la piastra a 96 pozzetti su ciascun lato per assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra il fondo di ciascun pozzetto.
   4. Sigillare la piastra con un foglio adesivo e incubare la piastra in frigorifero a 4 °C per una notte (12-16 h).
3. Blocco (giorno 2)
   1. Togliete il piatto dal frigo e togliete la pellicola.
   2. Rimuovere la soluzione di rivestimento dell'anticorpo gettandola nel cestello dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione di rivestimento dai pozzetti.
   3. Aggiungere 125 μl di soluzione bloccante per pozzetto. Sigillare nuovamente la piastra e posizionarla su uno shaker orbitale per micropiastre.
   4. Incubare la piastra per 90 minuti a temperatura ambiente agitando costantemente a 800 giri/min.
4. Preparazione di norme e campioni
   1. Durante il periodo di incubazione, preparare gli standard proteici MeCP2 e/o TAT-MeCP2 e vari campioni.
      nota: Il tampone di lisi utilizzato per la diluizione standard deve essere lo stesso utilizzato nei campioni analizzati.
   2. Prelevare una fiala di soluzione madre proteica MePC2 e/o TAT-MeCP2 (250 μg/mL), lisati cerebrali di topo e lisati HDF a partire da -80 °C. Scongelarli con ghiaccio.
   3. Diluire la soluzione madre standard (MeCP2 e/o TAT-MeCP2) in provette pulite secondo la Tabella 1.
   4. Diluire i campioni nel tampone di lisi come segue: 1-20 μg di lisato cerebrale di topo per 25 μL di tampone di lisi e 0,25-1 μg di lisato HDF per 25 μL di tampone di lisi. Preparare un volume sufficiente di ciascun campione per eseguire l'analisi in triplice copia.
5. Aggiunta dei campioni e delle soluzioni standard
   1. Rimuovere la soluzione bloccante infilandola nel cestino dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere tutta la soluzione bloccante dai pozzetti.
   2. Lavare la piastra 3 volte con 150 μL di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
   3. Aggiungere 25 ul di standard e campioni nell'angolo inferiore del pozzetto utilizzando una pipetta monocanale.
   4. Sigillare la piastra e incubare la piastra per 4 ore a temperatura ambiente agitando costantemente a 800 giri/min.
6. Anticorpo di rilevamento non marcato
   1. Scongelare l'anticorpo policlonale anti-MeCP2 del coniglio con ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:6.000 in soluzione di diluente per il saggio.
   2. Rimuovere gli standard e i campioni gettandoli nel cestino dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta.
   3. Lavare la piastra 3 volte con 150 μL di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
   4. Aggiungere 25 μl di anticorpo di rilevamento non marcato a ciascun pozzetto con il pipettatore multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per 1 ora agitando costantemente a 800 giri/min a temperatura ambiente.
7. Anticorpo coniugato specifico
   1. Estrarre l'anticorpo secondario specifico (Tabella dei materiali) dal frigorifero e metterlo sul ghiaccio. Diluire l'anticorpo 1:666.67 in soluzione di diluente per il saggio e mescolare delicatamente.
   2. Rimuovere l'anticorpo secondario libero non etichettato gettandolo nel cestino dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta.
   3. Lavare la piastra 3 volte con 150 μL di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.
   4. Aggiungere 25 μl di anticorpo coniugato specifico (Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto con il pipettatore multicanale. Sigillare la piastra e incubare per 1 ora agitando costantemente a 800 giri/min a temperatura ambiente.
8. Lettura della targa
   1. Rimuovere l'anticorpo coniugato libero (Tabella dei materiali) gettandolo nel cestino dei rifiuti e picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta.
   2. Lavare la piastra 3 volte con 150 μL di soluzione di lavaggio.
   3. Aggiungere alla piastra 150 μl di tampone di lettura in oro a base di Tris 1x (tabella dei materiali) con tensioattivo contenente tripropilammina come co-reagente per la generazione di luce. Evitare la formazione di bolle d'aria utilizzando tecniche di pipettaggio inverso.
   4. Posizionare la piastra sulla piattaforma di rilevamento della micropiastra (Tabella dei materiali) e avviare immediatamente la misurazione. Utilizzare le impostazioni per l'acquisizione di piastre a 96 pozzetti.
   5. Cattura i segnali di elettrochemiluminescenza da una telecamera CCD integrata in un sistema di rilevamento dell'elettrochemiluminescenza (Tabella dei materiali) e registra i conteggi dei segnali, che corrispondono alle unità di luce relativa (RLU) e sono direttamente proporzionali all'intensità della luce.
      nota: Dopo stimolazione elettrochimica, l'etichetta di rutenio legata all'elettrodo di carbonio emette luce di luminescenza a 620 nm. Analizza i dati con il software fornito con lo strumento (Tabella dei materiali).

Tabella 1: Serie standard da 0 a 1.800 ng/mL.