1. Reazioni ddPCR e preparazione alla generazione di goccioline
- Quantificare il DNA utilizzando un fluorimetro.
nota: Per il test drop-off, si raccomanda di utilizzare un intervallo di 3.000-30.000 copie del genoma aploide per reazione, che è progettato per rilevare eventi NHEJ con una sonda di marcatura HEX che si lega a una sequenza WT del sito di taglio mirato e non ricottura (drop-off) se c'è una delezione o un inserimento nel sito target, che indica la presenza di una variante NHEJ.
- Calcola il numero di copie utilizzando il peso del genoma aploide e la concentrazione di DNA nell'estratto. Questo viene fatto moltiplicando la concentrazione del DNA estratto per il volume utilizzato per ottenere la massa totale del DNA, quindi dividendolo per il peso del genoma aploide. Assicurarsi che il volume aggiunto sia compreso tra 1 e 10 μL. Diluire se necessario per rientrare nell'intervallo di copie del genoma aploide raccomandato.
nota: Si stima che il genoma di un aploide di Anopheles gambiae sia di 0,27 pg per zanzara adulta.
- Primer e sonde di progettazione. Progettare primer oligonucleotidici diretti e inversi con una temperatura di fusione del primer (Tm) nell'intervallo 55-60 °C che fiancheggiano le estremità 5' e 3' del sito bersaglio del gRNA producendo un amplicone di 150-400 bp.
- Sonda marcata con HEX (esacloro-fluoresceina) per la rilevazione di NHEJ: progettare un oligonucleotide di ~15-20 bp di lunghezza complementare al sito target e aggiungere la sonda HEX all'estremità 5' e BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) all'estremità 3'. La Tm della sonda di idrolisi deve essere di 3-10 °C superiore alla Tm dei primer.
- Sonda marcata con FAM (6-carbossifluoresceina) per WT di riferimento: progettare un oligonucleotide ~15-20 bp di lunghezza complementare a un sito genomico conservato distante (circa 25 bp) dal sito target e aggiungere la sonda FAM all'estremità 5' e BHQ1 all'estremità 3'. La Tm della sonda di idrolisi deve essere di 3-10 °C superiore alla Tm dei primer.
2. Preparazione della reazione PCR
- Preparare 25 μl della ddPCR Sample Mix con i seguenti componenti: ddPCR supermix per sonde (senza UTP): 12,5 μl, primer diretti e inversi (10 μM): 1 μl ciascuno, sonde HEX/FAM (10 μM): 0,625 μl ciascuna, DNA: 1-5 μl (3.750-37.500 copie del genoma aploide) e acqua: fino a 25 μl.
- Miscelare accuratamente le reazioni mediante pipettaggio a vortice o a riflusso (su e giù) (20x).
nota: Se le reazioni sono in una piastra a 96 pozzetti, pipettare l'intero volume su e giù 20 volte anziché vorticare per evitare la formazione di bolle.
- Centrifugare brevemente i campioni per depositare la miscela sul fondo della provetta o del pozzo.
nota: Assicurarsi che le reazioni siano a temperatura ambiente per la generazione di goccioline. Preparare 1 volta la miscela ddPCR per i pozzetti extra/inutilizzati in ciascuna cartuccia (ogni cartuccia ha 8 pozzetti).
3. Generazione di goccioline
- Utilizzando una pipetta multicanale da 50 μl, caricare 20 μl della miscela di campioni ddPCR nella fila centrale della cartuccia (Figura 1A, in alto).
- Caricare 70 μl di olio nella fila inferiore. Caricare 20 μl di supermiscela 1x ddPCR in pozzetti inutilizzati.
nota: Non introdurre bolle.
- Posizionare la guarnizione toccando solo i bordi, evitando la zona concava centrale (Figura 1B).
- Posizionare saldamente la piastra nel generatore di gocce e chiudere il coperchio per iniziare la corsa.
- Utilizzando la pipetta multicanale, trasferire 40 μl della miscela di emersione dalla fila superiore della cartuccia (Figura 1A, in basso) nella piastra a 96 pozzetti.
- Aspirare il campione liquido per 3-5 s con un angolo di 45-30°. Espellere lentamente il composto per oltre 3 s con un angolo di 45° nel lato del pozzo, lasciandolo sgocciolare lungo il lato. Va bene andare al secondo arresto (espulsione completa) della pipetta per espellere tutto il liquido.
- Utilizzando termosaldature a caldo, sigillare le piastre per 5 s a 180 °C.
4. Misurazione della PCR
- Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore (Figura 1C) e impostare le condizioni PCR consigliate se si seguono le linee guida NHEJ Drop-Off come segue:
- Denaturazione iniziale a 95 °C per 10 min.
- Impostare 40 cicli a 94 °C per 30 s per la denatura, 55 °C per 1 min per la ricottura e 60 °C per 2 min per l'estensione.
- Mantenere la temperatura a 98 °C per 10 min.
- Mantenere a 4 °C.
nota: La temperatura di ricottura per primer e set di sonde specifici può essere ottimizzata utilizzando un gradiente termico. Utilizzare una velocità di rampa di 2 °C/s per tutti i passaggi. Le condizioni di PCR devono essere regolate in base a ciascun disegno e configurazione sperimentale.
5. Lettura delle goccioline
- Posizionare saldamente la piastra nel lettore di gocce con il pozzetto A-1 in alto a sinistra (angolo smussato, gli altri tre sono bordati) (Figura 1D).
- Impostare la piastra nel programma: Designare FAM come canale di riferimento noto e HEX come canale sconosciuto (Figura 2A).
- Eseguire l'esperimento di lettura Droplet come quantificazione diretta. Al termine dell'esecuzione, modificare il tipo di esperimento in Drop-Off (DOF) per l'analisi (Figura 2A).
