Reazione a catena della polimerasi a gradiente per determinare la temperatura di ricottura ottimale

Abstract

Fonte: Tsujimoto, H. et al., Indel Rilevamento a seguito della mutagenesi CRISPR/Cas9 utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione nella zanzara Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra la reazione a catena della polimerasi in gradiente per l'ottimizzazione della temperatura di ricottura dei primer, che imposta la temperatura di ricottura in gradiente lungo i pozzi. L'effetto delle diverse temperature di ricottura è determinato dalla resa di prodotti amplificati che aiutano a ottimizzare la condizione di reazione.

Protocollo

1. Scansione di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), progettazione di primer HRMA e convalida di primer

1. Identificazione di SNP in colonie di zanzare di laboratorio wild-type
   1. Selezionare l'esone bersaglio per interrompere la corretta traduzione del polipeptide.
      nota: Il bersaglio dovrebbe essere vicino al codone iniziale o tra i residui chiave necessari per la funzione proteica. Più corto è l'esone (ad esempio, ≤200 basi), più difficile è il bersaglio e l'analisi. Evitare di modificare vicino ai confini di un esone, poiché ciò costringe uno dei primer HRMA ad attraversare un introne o a trovarsi in un introne. Questo non è auspicabile perché i tassi di SNP tendono ad essere molto più alti in quelle regioni.
   2. Design del primer
      1. Vai al sito NCBI Blast - Primer Blast, copia e incolla l'esone scelto nella casella nella parte superiore della pagina | scegli la dimensione del prodotto PCR (assicurati che includa la maggior parte dell'esone) | scegli l'organismo.
      2. Clicca su Parametri avanzati | Optare (per PCR Product Tm) e aggiungere 60 (per una temperatura ottimale di 60 °C) | Ottieni i primer. Mantenete gli altri parametri come predefiniti.
   3. Ottenere il DNA genomico (gDNA) dalla colonia di laboratorio wild-type. Metti da parte 10 zanzare, anestetizzale con CO₂ e mettile in una capsula di Petri sul ghiaccio per mantenerle inattive. Preparare 10 provette contenenti 0,5 μL di reagente per il rilascio del DNA dal tessuto e 20 μL di tampone di diluizione, entrambi forniti nel kit di rilascio del DNA suggerito nella Tabella dei Materiali.
   4. Rimuovere una zampa da una singola zanzara usando una pinza e metterla in un tubo corrispondente di una soluzione diluita del reagente per il rilascio del DNA (dal passaggio 1.1.3), immergendo completamente la zampa nella soluzione. Ripeti questo passaggio con le zanzare rimanenti, pulendo la pinza con etanolo al 70% prima di procedere con quella successiva.
   5. Incubare la soluzione contenente le gambe a temperatura ambiente per 2-5 minuti, quindi a 98 °C per 2 minuti e lasciarla raffreddare mentre si prepara la reazione di PCR.
      nota: Le piastre contenenti il gDNA rilasciato possono essere conservate a -20 °C e a questo punto il protocollo può essere messo in pausa.
   6. Preparare 10 provette contenenti 10 μl di 2x PCR Master Mix, primer a una concentrazione finale di 0,5 μM e acqua di grado molecolare a un volume finale di 20 μl e trasferire 1 μl del campione diluito in ciascuna provetta. Eseguire la PCR seguendo questi parametri ciclici: 98 °C 5 min, 40 cicli di 98 °C per 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s per kb; allungamento finale di 72 °C per 1 min.
   7. Purificare i prodotti PCR con un enzima per degradare i primer PCR residui e defosforilare i dNTP in eccesso o qualsiasi kit di pulizia della colonna. Procedere con il sequenziamento dei campioni.
   8. Analizza ogni elettroferogramma per la presenza di doppi picchi/basi ambigue e regola manualmente le chiamate di base in ogni sequenza utilizzando il codice di base degenerato appropriato.
      nota: Questo passaggio deve essere eseguito prima dell'allineamento di sequenze multiple, poiché è comune per il software di chiamata di base selezionare il picco più prominente come "vero" richiamo di base, dando la falsa impressione di un'assenza di SNP.
   9. Esegui un allineamento di sequenze multiple utilizzando il software di allineamento, SeqMan Pro, elencato nella Tabella dei materiali o altri software di allineamento open source, come ClustalW o T-Coffe.
      1. Aprire il software di allineamento | fare clic su Aggiungi sequenze | selezionare le sequenze desiderate e fare clic su Aggiungi | Una volta scelte tutte le sequenze, fare clic su Fine.
      2. Fare clic su Assembla per eseguire l'allineamento. Per aprire l'allineamento, fare clic su Contig 1 e analizzare l'allineamento e identificare gli SNP (Figura 1).
         nota: In alternativa alle fasi 1.1.3-1.1.6, la PCR può essere eseguita da DNA genomico isolato ottenuto da campioni di massa (derivati da >10 individui). Gli ampliconi sequenziati possono essere analizzati direttamente per la presenza di SNP che appaiono come doppi picchi nell'elettroferogramma, anche se gli SNP rari saranno più difficili da rilevare.
   10. Progettare 3-5 RNA guida singola (sgRNA), evitando le regioni contenenti qualsiasi SNP identificato sopra, seguendo il protocollo descritto in.

2. Progettazione del primer HRMA

1. Testare la sequenza dell'esone per la possibile formazione di strutture secondarie durante la PCR utilizzando mFold.
   1. Vai al server Web UNAFold | clicca su mFold | nel menu a tendina, clicca su Applicazioni | Forma di piegatura del DNA.
   2. Inserisci il nome della sequenza nella casella e incolla l'esone.
   3. Modificare la temperatura di ripiegamento a 60 °C; nelle condizioni ioniche, modificare [Mg⁺⁺] in 1,5 e in Unità passare a mM; fare clic su Piega DNA.
   4. Su Output, sotto Struttura 1, fare clic su pdf per aprire i grafici della struttura circolare.
2. Vai a NCBI Blast - Primer Blast per la progettazione del primer.
3. Copia e incolla la sequenza dell'esone selezionata determinata dal sequenziamento nel passaggio 1.1 (la sequenza che contiene il numero più basso di SNP o nessun SNP) nella casella nella parte superiore della pagina.
4. Utilizzare il simbolo < > per contrassegnare ed escludere le sequenze che contengono SNP, il sito di destinazione e le regioni con possibile formazione di struttura secondaria.
5. Seleziona la dimensione del prodotto PCR tra 80 e 150 bp e scegli l'organismo.
   nota: È possibile utilizzare con successo frammenti di dimensioni maggiori (~300 bp). Tuttavia, ampliconi più lunghi possono diminuire la sensibilità tra sequenze che differiscono in una o solo poche coppie di basi.
6. Fare clic su Ottieni primer. Selezionare 2-3 coppie di primer da testare (idealmente, i siti di primer si trovano a ≥20-50 bp di distanza da qualsiasi sito target CRISPR).

3. Convalida del primer

1. Eseguire una PCR a gradiente utilizzando il gDNA di un singolo individuo.
   1. Preparare una miscela master e prelevare un campione per il controllo senza stampo (NTC) in una provetta separata. Aggiungere il modello alla miscela master rimanente e aliquotare in una piastra a 96 pozzetti.
   2. Seguire i parametri del ciclo: 98 °C 30 s, 34 cicli a 98 °C per 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; estensione finale a 72 °C per 10 min.
   3. Generare profili di fusione termica seguendo i parametri: fase di denaturazione 95 °C per 1 minuto, ricottura 60 °C per 1 minuto, rilevamento della curva di fusione tra 75 °C e 95 °C con incrementi di 0,2 °C, con un tempo di mantenimento di 10 s ad ogni temperatura.
      nota: Devono essere utilizzate solo temperature di ricottura con un singolo profilo di fusione termica.

Risultati

Figura 1: Identificazione SNP. Rappresentazione schematica dell'allineamento di sequenze multiple del frammento AaeZIP11 da wild-type. In rosso ci sono gli SNP e in verde ci sono i frammenti privi di SNP; questa regione priva di SNP è suggerita per la progettazione di sgRNA e primer. Abbreviazioni: SNP = polimorfismo a singolo nucleotide; sgRNA = RNA guida singolo; LVP = Cep...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
70% Etanolo			Soluzione di etanolo al 70% in acqua
Piastre per PCR a 96 pozzetti e PCR in tempo reale	VWR	82006-636	Per ottenere il DNA genomico (dalla zampa della zanzara)
Modelli di piastre a 96 pozzetti			Stampato in casa, per la registrazione del genotipo
Bio Rad CFX96	Rabbia bio		Macchina per PCR con funzionalità di gradiente e HRMA
Serbatoi di reagenti biotecnologici diversificati	VWR	Codice 490006-896
Kit di pulizia rapida PCR Exo-CIP	Biolaboratori del New England	E1050S
Piastra di Petri in vetro	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Nunc Nastro sigillante poliolefinico acrilato, Thermo Scientific	VWR	37000-548	Da utilizzare con le piastre PCR a 96 pozzetti per ottenere DNA genomico
Kit PCR diretto per tessuti animali Phire (senza strumenti di campionamento)	Thermo Fisher	F140WH	Per l'ottenimento del DNA genomico e l'esecuzione della PCR
Software di analisi della fusione di precisione	Rabbia bio	1845025	Utilizzato per la genotipizzazione dei campioni di DNA di zanzara e l'analisi delle proprietà di denaturazione termica del DNA a doppio filamento (vedere la fase 3.3 del protocollo)
Pipettatore monocanale	Gilson
Kit PCR diretto per tessuti animali Phire (senza strumenti di campionamento)	Thermo Fisher	F140WH	Per l'ottenimento del DNA genomico e l'esecuzione della PCR
SeqMan Pro	Software DNAstar Lasergene		Per l'allineamento di sequenze multiple
Pipettatore monocanale	Gilson