PCR digitale duplex per la quantificazione simultanea di doppi marcatori genetici

Abstract

Fonte: Cao, Y., et al. Un test PCR digitale duplex per la quantificazione simultanea dell'Enterococcus spp. e il marcatore HF183 associato alle feci umane in Waters. J. Vis. Exp. (2016)

In questo video, dimostriamo la tecnica della PCR digitale duplex (ddPCR), una modifica della tradizionale tecnica PCR utile per rilevare contemporaneamente due diversi marcatori genetici. Una singola reazione PCR viene suddivisa in goccioline emulsionate di dimensioni nanolitrometriche che vengono amplificate in modo indipendente e il rilevamento di segnali di amplificazione della fluorescenza di colore diverso dalla frazione di goccioline viene utilizzato per calcolare la concentrazione iniziale delle sequenze target.

Protocol

1. Preparazione della miscela di saggi

1. Effettuare concentrazioni stock di 100 μmol/L per tutti i primer in acqua di grado molecolare e sonde in tampone TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   NOTA: Le sonde per i due bersagli sono marcate in fluorescenza con fluorofori diversi, come indicato nell'elenco dei materiali/apparecchiature.
2. Preparare la miscela master mescolando, per reazione pianificata, 12 μl di miscela per PCR digitale (2x stock, vedere l'elenco dei materiali/apparecchiature), 0,216 μl di primer diretto e inverso, 0,06 μl di sonda fluorescente e 5,016 μl di acqua priva di nucleasi (concentrazione finale: 900 nM per primer, 250 nM per sonda). Pipettare su e giù almeno 10 volte per miscelare, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione.
3. Pipettare la miscela master da 18 μl (dalla fase 1.2) in una normale provetta o piastra per PCR, mescolando in un modello di DNA da 6 μl (estratto come descritto in precedenza) per ottenere una miscela di test per la generazione di goccioline. Se si analizzano i campioni in duplicato, pipettare 36 μl di master mix e 12 μl di DNA in ciascun pozzetto. Lasciare vuoti i pozzetti di replica corrispondenti sulla piastra. Includere controlli positivi (vedi Elenco di materiali/attrezzature) e nessun controllo modello (NTC) (cioè con acqua di grado molecolare utilizzata come modello).
   nota: Il controllo positivo è necessario per garantire che il test funzioni correttamente e l'NTC è necessario per garantire che non vi siano contaminazioni all'interno della piastra e per impostare la linea di base fluorescente in un secondo momento nell'analisi dei dati. Si consiglia agli utenti alle prime armi di utilizzare sia campioni di DNA non diluiti che diluiti.

2. Generazione di goccioline e configurazione della piastra PCR

1. Miscelare le miscele di saggi pipettando su e giù circa 15 volte utilizzando una pipetta multicanale. Assicurarsi che il puntale della pipetta rimanga all'interno del liquido per evitare di formare bolle in eccesso all'interno della miscela.
2. Inserire la cartuccia 1 (contenente 8 pozzetti) in un portacartucce bianco e chiudere il portacartuccia. La cartuccia 1 è ora saldamente in posizione e non può essere rimossa dall'holder durante la generazione di goccioline. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire delicatamente 20 μl di miscela di saggio nella posizione centrale della cartuccia contrassegnata con "Campione" senza introdurre bolle d'aria.
3. Pipettare 70 μl di olio per la generazione di goccioline sul lato sinistro della cartuccia (contrassegnato con "Olio").
4. Coprire la cartuccia con una guarnizione assicurandosi che la guarnizione sia piatta e tenuta uniformemente dai 4 tick verso il bordo della cartuccia. Premere il pulsante verde sul generatore di gocce per aprire e posizionare la cartuccia. Premere nuovamente il pulsante verde per chiudere il generatore.
   nota: Una volta che la porta si chiude, il pulsante viene disattivato, la porta non può essere riaperta e la generazione di goccioline inizia immediatamente continuando per circa 1 minuto.
5. Se si eseguono più di 8 reazioni, posizionare la cartuccia 2 in un secondo supporto per cartuccia bianco e prepararsi allo stesso modo della cartuccia 1 mentre è in corso la generazione di goccioline per risparmiare tempo totale di configurazione.
6. Aprire lo sportello del generatore di gocce quando il pulsante illuminato diventa verde indicando il completamento della generazione delle gocce. Rimuovere il supporto della cartuccia bianco contenente la cartuccia 1, metterlo da parte e posizionare la cartuccia 2 sul generatore di gocce.
7. Rimuovere la guarnizione dalla cartuccia 1 e gettarla. Trasferire delicatamente il volume totale (circa 40 μl) delle goccioline generate dalla terza colonna della cartuccia (contrassegnate con "Goccioline") su una piastra PCR finale (mantenuta a temperatura ambiente) per i cicli termici.
   nota: Non sganciare il supporto della cartuccia bianco poiché l'azione potrebbe rompere le goccioline appena generate; Aprire il supporto della cartuccia solo dopo che le goccioline sono state trasferite sulla piastra finale.
8. Ripetere i passaggi 2.1-2.7 per ulteriori campioni.
9. Quando tutte le goccioline sono nella piastra PCR finale, posizionare un coperchio di alluminio perforabile sopra la piastra e posizionarlo su una sigillatrice per piastre. Impostare il sigillante a 180 °C, premere 'Play' sul sigillante e lasciare sigillare per 10 secondi.

3. Ciclo termico e lettura delle goccioline

1. Posizionare la piastra sigillata sul termociclatore, compatibile con la piastra PCR finale utilizzata nella fase 2.7, e una velocità di rampa della temperatura di 2,0 °C/sec.
2. Eseguire il programma termico come segue: 10 minuti a 95 °C, seguiti da 40 cicli di 30 secondi a 94 °C e 60 secondi a 60 °C, seguiti da un mantenimento di 10 minuti a 98 °C (opzionale: mantenimento finale a 4 o 15 °C).
3. Al termine del ciclo, trasferire la piastra in un lettore di gocce per la misurazione automatica della fluorescenza in ciascuna gocciolina in ciascun pozzetto. In alternativa, conservare la piastra a 4 °C per un massimo di 3 giorni prima della lettura delle goccioline. Assicurarsi che le goccioline siano a temperatura ambiente prima di procedere con la lettura.
   1. Aprire il software in dotazione per impostare la lettura delle goccioline. Nel menu predefinito "Configurazione" contenente uno schema di una piastra vuota da 96 pozzetti, fare doppio clic sul pozzetto A1 per aprire il menu contenente tre sezioni: "Campione", "Saggio 1" e "Saggio 2".
   2. Nella sezione "Campione", digita l'ID del campione nella casella "Nome" e premi invio o seleziona la casella a destra contrassegnata con "Applica". Quindi, fai clic sul menu a discesa con l'etichetta "Esperimento" e scegli "ROSSO" (rilevamento di eventi rari), quindi fai clic su Invio.
   3. Passare alla sezione "Saggio 1". Nella sezione "Nome" compilare il test (ad es. Enterococcus) e fare clic su Invio. Nella casella sottostante denominata "Tipo", fai clic sul menu a discesa e scegli "Canale 1 sconosciuto" e fai clic su invio.
   4. Passare alla sezione "Saggio 2". Nella sezione "Nome" compilare il test (ad es. HF183) e fare clic su Invio. Nella casella sottostante denominata "Tipo", fai clic sul menu a discesa e scegli "Canale 2 sconosciuto" e fai clic su invio. Tutte le informazioni dai passaggi da 3.3.2 a 3.3.4 sono ora presenti nel pozzetto A1.
   5. Assegnare un nome a tutti i pozzetti successivi contenenti goccioline. Per risparmiare il tempo totale di configurazione, fai clic su "Maiusc" o "Ctrl" per scegliere più pozzetti contemporaneamente.
   6. Quando la rappresentazione digitale della targa rispecchia la targa fisica, premere "OK" in basso a destra del menu. Nel nuovo menu che appare nella parte superiore dello schema della targa, nella sezione "Modello" scegli "Salva con nome" e assegna un nome e salva la targa.
   7. A sinistra dello schermo, fai clic su "Esegui" e seleziona il set di coloranti appropriato nella finestra pop-out "Opzioni di esecuzione". La raccolta dei dati viene avviata e visualizzata in tempo reale nel software.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microprovette a basso legame	Costar	Telefono 3207	Per la conservazione di reagenti, campioni/produzione di miscele master
Acqua priva di nucleasi	FisherSci	BP2484-50
tampone pH 8 TE	FisherSci	BP2473-100
Piastra rigida a 96 pozzetti	BioRad	HSP-9601	Per la master mix iniziale e l'inoculazione del campione
Pellicola sigillante in alluminio	BioRad	Codice 359-0133	Per sigillare la piastra del campione
Generatore di goccioline	BioRad	Codice 186-3002
Olio per la generazione di goccioline	BioRad	186-3005
cartuccia	BioRad	Codice 186-4008
Porta cartuccia DG8	BioRad	Codice 186-3051
guarnizione	BioRad	Codice 186-3009
20uL puntali per pipette	Rainin	GP-L10F	Per il trasferimento del campione/master mix alla cartuccia
Puntali per pipette da 200uL	Rainin	GP-L200F	Per il trasferimento delle goccioline alla piastra Twin.Tec finale
Piastra Twin.Tec a 96 pozzetti	Eppendorf	951020320	Per il ciclo termico e la lettura delle goccioline finali
Lamina termosaldabile perforabile	BioRad	Codice 181-4040	Per sigillare la piastra Twin.Tec prima del ciclo termico
Sigillante per piastre PCR PX1	BioRad	181-4000	È necessario solo il termociclatore, nessuna ottica
CFX96 Termociclatore	BioRad	CFX96 e C1000
Lettore di gocce QX100	BioRad	186-3001
Olio per lettore di gocce	BioRad	Codice 186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	Codice 186-3024	cioè la miscela PCR digitale nel manoscritto
Software QuantaSoft (v1.3.2)	Quantasoft	Modellino QX100	Per la visualizzazione, l'analisi e l'esportazione dei dati ddPCR
Entero Forward Primer (Ent F1A)	operone	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	È possibile utilizzare un fornitore alternativo
Entero Reverse Primer (Ent R1)	operone	CAGTGCTCTACCTCCATT	È possibile utilizzare un fornitore alternativo
Sonda Entero (GPL813TQ)	operone	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	È possibile utilizzare un fornitore alternativo, ma il fluoroforo deve essere FAM
HF183 Primer in avanti (HF183-1)	operone	ATCATGAGTTCACATGTCCG	È possibile utilizzare un fornitore alternativo
HF183 Innesco inverso (BthetR1)	operone	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	È possibile utilizzare un fornitore alternativo
Sonda HF183 (BthetP1)	operone	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	È possibile utilizzare un fornitore alternativo, ma il fluoroforo deve essere HEX (se si utilizza VIC, è necessario scegliere la compensazione matric appropriata).
Controllo positivo			Miscela di DNA genomico di E.faecalis e plasmide standard HF183 (ordinato da IDT). Per i metodi dettagliati nella coltura di E. faecalis e le sequenze del plasmide HF183 ordinato, si veda Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Gli standard di DNA di Enterococcus disponibili in commercio (ATCC 29212Q-FZ) possono essere utilizzati anche nel controllo positivo al posto del DNA genomico di E. faecalis preparato in laboratorio.