1. Quantificazione dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi
- Assicurarsi che le impostazioni dello spettrofotometro siano impostate su RNA.
- Utilizzare 1-2 μl di acqua di grado molecolare per inizializzare la macchina e impostare una linea di base.
- Utilizzare 1-2 μl di ciascun campione di RNA del test per valutare la quantità di RNA.
- Salva le letture e il documento.
- Regolare l'RNA a 1 μg/μL, se necessario.
nota: L'RNA deve essere mantenuto sempre in ghiaccio (o in un blocco fresco). Se l'RNA viene ottenuto utilizzando una colonna o un metodo basato su microsfere, l'RNA è solitamente inferiore a 1 μg/μL. In questa situazione usa l'RNA pulito.
2. Preparazione di serie di diluizione dell'RNA per determinare la sensibilità del punto finale
- Effettuare una diluizione seriale di 10 volte dell'RNA.
- Etichettare le provette con la serie di diluizione (ad es. 10-1, 10-2, ecc.) e i dettagli dell'RNA.
- Aggiungere 45 μl di acqua di grado molecolare a ciascuna provetta.
- Aggiungere 5 μL di RNA (precedentemente diluito a 1 μg/μL) e mescolare bene.
- Smaltire il puntale della pipetta nel disinfettante appropriato e sostituirlo con un puntale nuovo.
- Prelevare 5 μl dalla provetta 10-1 e aggiungerla alla provetta 10-2 e mescolare bene.
- Ripetere 2.1.3-2.1.5 con le diluizioni rimanenti.
NOTA: L'RNA deve essere mantenuto sempre in ghiaccio (o in un blocco fresco).
3. Preparazione delle reazioni di RT-PCR in tempo reale
- Utilizzando un foglio di calcolo, pianificare il layout della piastra in base al numero di campioni di test e campioni di controllo, sia per i saggi di lyssavirus che per quelli di ß-actina.
nota: Se 4 campioni devono essere testati in doppio con controllo positivo e negativo, ciò equivale a 10 reazioni per entrambi i test.
- In una "camera bianca" o in un'area separata dal modello di RNA, pulire le superfici con un disinfettante appropriato prima dell'uso o preparare una workstation PCR (se in uso). Per preparare la postazione di lavoro, pulire la superficie dell'armadio con un disinfettante appropriato e posizionare gli oggetti necessari nella postazione di lavoro e chiudere le porte. Accendere la luce UV per 10 minuti.
- Rimuovere i regents e i primer dal congelatore e scongelare (reagenti elencati nella Tabella 1 e primer nella Tabella 2).
NOTA: La miscela enzimatica è conservata nel glicerolo, quindi non richiede lo scongelamento e deve essere conservata sempre in ghiaccio (o in un blocco fresco). Tutti gli altri reagenti possono essere scongelati a temperatura ambiente.
- Una volta scongelati, mescolare i reagenti e centrifugare brevemente per raccogliere il liquido.
NOTA: Non agitare la miscela enzimatica, centrifugare brevemente.
- Preparare miscele master separate per lyssavirus e ß-actina. Per ogni reazione, aggiungere 7,55 μl di acqua di grado molecolare, 10 μl di 2x miscela di reazione verde Universal SYBR, 0,6 μl di primer diretto, 0,6 μl di primer inverso, 0,25 μl di miscela enzimatica iTaq RT.
- Utilizza un foglio di calcolo per calcolare i volumi corretti ed evitare errori nel calcolo manuale. Assicurarsi che sia preparata una quantità sufficiente di master-mix per compensare gli errori di pipettaggio. Pertanto, se sono necessarie 10 reazioni (vedere la NOTA al punto 3.1), preparare 12 reazioni
- Preparare il master-mix con ghiaccio (o in un blocco freddo) e rimanere sul ghiaccio fino a quando non viene inserito nella macchina in tempo reale.
- Miscelare le master-miscele preparate, centrifugare brevemente ed erogare 19 μl negli appositi pozzetti delle provette a strisce o in una piastra a 96 pozzetti compatibile con la macchina in tempo reale in uso.
NOTA: Ridurre al minimo la produzione di bolle nei pozzetti durante il pipettaggio.
- In una stanza separata, o in una camera UV preparata come descritto al punto 3.2, aggiungere con cautela 1 μL di RNA precedentemente regolato a 1 μg/μL (vedere il passaggio 1.5) sotto la superficie del pozzetto di miscelazione master appropriato e mescolare delicatamente. Gettare il puntale della pipetta nel disinfettante subito dopo l'uso (sotto la superficie).
- Aggiungere i controlli dopo i campioni di prova, con il controllo positivo aggiunto successivamente e il controllo senza modello (NTC – acqua di grado molecolare) aggiunto per ultimo. La quantità di RNA utilizzata può essere modificata a seconda del tipo di campione e dell'estrazione dell'RNA utilizzata. La quantità utilizzata deve essere convalidata per garantire che la reazione sia ottimizzata.
- Sigillare la piastra utilizzando coperchi a strisce o sigillante, facendo attenzione a garantire che tutti i coperchi siano ben chiusi ed etichettati a sufficienza per orientare i campioni. Etichettare il bordo dei tubi della piastra/striscia.
- Centrifugare i campioni utilizzando una centrifuga per raccogliere tutto il liquido sul fondo dei pozzetti.
- Trasferire la piastra alla macchina per PCR in tempo reale, aprire lo sportello e posizionarla nel supporto garantendo la corretta posizione/orientamento dei campioni in base al layout della piastra.
NOTA: Se si utilizzano strisce di tubi, assicurarsi che il supporto sia in posizione.
- Apri il programma della macchina PCR in tempo reale e scegli l'opzione per l'esperimento in tempo reale SYBR con curva di dissociazione. Programmare la macchina per PCR in tempo reale utilizzando le condizioni di ciclo termico specificate nella Tabella 3, compresi i punti di raccolta dei dati.
- Selezionare SYBR come colorante fluorescente e selezionare sconosciuto come tipo di campione e inserire un nome nella casella del nome del campione corretta.
nota: Differenziare tra le repliche e anche tra il lyssavirus e i pozzetti di ß-actina.
- Scegliere una posizione di file per salvare i dati sperimentali, assicurarsi che la lampada venga spenta alla fine della corsa, quindi avviare la corsa.
NOTA: Poiché il primo passaggio è uno stadio RT, durante questo periodo non vengono raccolti dati, pertanto, se la lampada richiede un periodo di riscaldamento, ciò può verificarsi durante lo stadio RT. La macchina e il software real-time visualizzeranno le curve di amplificazione in tempo reale, mentre la curva di fusione verrà generata alla fine del ciclo.
