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1. Estrazione del DNA da tessuto FFPE, sangue periferico e aspirato di midollo osseo
- Per tessuto FFPE del midollo osseo con kit di estrazione FFPE del DNA
- Iniziare con tessuto FFPE da vetrini non colorati (5 - 10 sezioni a 5 - 10 μm di spessore).
nota: Se si inizia con trucioli di tessuto, utilizzare 3 - 6 sezioni a 5 - 10 μm di spessore e saltare al passaggio 1.1.6.
- Posizionare i vetrini in un cestello per vetrini e preparare quattro serbatoi di lavaggio (due per lo xilene e due per l'alcol al 100%). Aggiungere un volume minimo di 600 ml di soluzione a ciascun cestello.
- Deparaffinare i vetrini eseguendo un lavaggio di 5 minuti con xilene nel primo vassoio. Trasferire i vetrini nel secondo serbatoio di lavaggio dello xilene per altri 5 minuti.
- Dopo la deparaffinazione, lavare i vetrini con alcol al 100% per 5 minuti. Trasferire i vetrini nel secondo serbatoio di lavaggio con alcol per altri 5 minuti.
- Lasciare asciugare completamente i vetrini sotto una cappa prima di raschiarli con una lama di rasoio in una provetta da microcentrifuga.
nota: Se è disponibile un vetrino H&E con la regione tumorale indicata, allineare i vetrini e raschiare solo la regione tumorale.
- Procedi con le istruzioni della dispensa del produttore inclusa nel kit.
- Per l'aspirato BM e il sangue periferico
- Estrarre secondo le istruzioni del produttore con queste specifiche.
nota: Esistono numerosi kit e metodi disponibili in commercio per l'estrazione del DNA da tessuti e cellule FFPE. In pratica, tutti possono essere utilizzati. Utilizzare un metodo stabilito in laboratorio.
- Utilizzare 200 μL di sangue periferico (PB) o 100 μL di BM + 100 μL di PBS.
- Utilizzare 4 μL di RNasi A di soluzione madre.
- Eluire con 100 μl di tampone di eluizione.
- Quantificazione del DNA
- Misurare le concentrazioni di DNA utilizzando uno spettrofotometro che garantisce un rapporto 260 nm/280 nm di circa 1,8 (per il DNA puro). Se il rapporto è sensibilmente più basso, può indicare la presenza di proteine, fenolo o altri contaminanti che possono interferire con le applicazioni a valle.
- Regolare le concentrazioni di DNA a circa 50 - 100 ng/μL con un tampone di eluizione appropriato.
2. PCR di blocco wild-type
- Progettazione del primer
- Progettare e ottenere primer per geni di interesse secondo le linee guida generali precedentemente descritte per la progettazione di primer PCR. Includere primer di sequenziamento universale M13-forward e reverse nei primer PCR.
nota: Il test MYD88 è stato sviluppato per amplificare l'esone 5 di MYD88 (G259 - N291) e 110 nucleotidi situati nella regione intronica 5' per coprire il sito di splicing e parte dell'introne 4. Gli inneschi in avanti e in avanti sono stati progettati con una sequenza 5'-M13 (M13- in avanti: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-reverse: cag gaa aca gct atg acc) per consentire la ricottura di primer di sequenziamento complementari (vedi Tabella dei materiali).
- Design dell'oligonucleotide dell'acido nucleico bloccato
- Progettare l'oligonucleotide bloccante in modo che sia lungo circa 10 - 15 basi e complementare al modello WT in cui si desidera l'arricchimento mutante.
nota: Un oligo più corto migliorerà la discriminazione del mismatch. Per ottenere un'elevata specificità del bersaglio, è importante non utilizzare troppi nucleotidi bloccanti poiché ciò può portare a un oligonucleotide molto "appiccicoso". Il contenuto, la lunghezza e il nucleotide bloccante devono essere ottimizzati in base al nucleotide specifico che deve essere bloccato. È importante raggiungere un'elevata specificità di legame senza compromettere la struttura secondaria e rischiare l'auto-complementarietà.
- Progettare l'oligo bloccante in modo che abbia una Tm 10 - 15 °C al di sopra della temperatura di estensione durante il termociclo. Regolare la Tm aggiungendo o rimuovendo le basi di blocco o sostituendo le basi di blocco al DNA evitando lunghi tratti (3 - 4 basi) di basi G o C di blocco.
- Accedere al sito Web degli strumenti Oligo (vedere la tabella dei materiali) e selezionare lo strumento "blocco della previsione Oligo TM".
- Incollare la sequenza del modello WT che si desidera bloccare nella casella "Oligo Sequence". Aggiungi "+" davanti alle basi per indicare le basi di blocco.
- Selezionare il pulsante "Calcola" per determinare la Tm approssimativa dell'ibrido DNA-Blocker.
- Progettare l'oligo bloccante per evitare la formazione di strutture secondarie o autodimeri.
- Accedere al sito Web degli strumenti Oligo (vedere la Tabella dei materiali) e selezionare lo strumento "Blocco Oligo Optimizer".
- Incollare la sequenza del modello WT che si desidera bloccare nella casella. Aggiungi "+" davanti alle basi per indicare le basi di blocco.
- Seleziona le due caselle "Struttura secondaria" e "Solo auto". Premere il pulsante Analizza per esaminare l'oligo alla ricerca di strutture secondarie o autodimeri potenzialmente problematici.
nota: I punteggi rappresentano stime molto approssimative delle Tm delle strutture secondarie e degli autodimeri. Punteggi più bassi sono quindi ottimali e possono essere ottenuti limitando l'accoppiamento bloccante-bloccante. L'oligonucleotide bloccante per MYD88 [bloccante MYD88 (TCAGA+AG+C+G+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)] è stato progettato per coprire gli amminoacidi Q262-I266 e presenta un dT 3'-invertito per inibire sia le estensioni da parte della DNA polimerasi che la degradazione da parte della 3'-esonucleasi. Questo specifico oligo bloccante è un 17 mer con 10 basi bloccanti che sono indicate come "+N". Le restanti 7 basi sono nucleotidi ordinari del DNA.
- Impostazione WTB-PCR e termociclo
- Preparare una master mix WTB-PCR (MMX) utilizzando 2,5 μL di tampone di reazione PCR 10x con 20 mM di MgCl2, 250 μM di dNTP, 0,2 μM di primer diretto e inverso, 1,2 μM di bloccante MYD88 e DNAsi, privo di RNAsi, H2O ultrapuro per creare un volume di soluzione finale di 21,75 μL per reazione.
nota: Le concentrazioni di lavoro si riferiscono al volume finale di reazione di 25 μl (dopo l'aggiunta del modello di DNA e della polimerasi). La PCR convenzionale MMX viene preparata semplicemente omettendo l'aggiunta di un bloccante. Tutte le fasi del protocollo rimangono identiche sia per la WTB che per la PCR convenzionale. Questo può essere utilizzato per convalidare e determinare l'arricchimento ottenuto con l'aggiunta di un bloccante.
- Quando si calcola la quantità di MMX da preparare, assicurarsi di tenere conto di 3 reazioni aggiuntive (controlli positivi e negativi e un controllo senza modello per verificare la presenza di contaminazione) e almeno 1 reazione aggiuntiva per errore di pipettaggio.
- Vortex MMX accuratamente. L'MMX può essere conservato a -80 °C per un massimo di un anno.
- Aggiungere 0,25 μl di Taq DNA polimerasi per reazione all'MMX e capovolgere per mescolare. Una volta che la polimerasi è stata aggiunta all'MMX, mantenerla in ghiaccio.
- Mettere una nuova piastra PCR a 96 pozzetti su una piastra fredda e pipettare 22 μl di MMX con la polimerasi in ogni pozzetto di reazione.
- Aggiungere 3 μL di DNA genomico (50 - 100 ng/μL) a ciascuno dei pozzetti contenenti l'MMX con la polimerasi.
- Sigillare brevemente la piastra e centrifugare per assicurarsi che la soluzione raggiunga il fondo di ogni pozzetto.
- Caricare la piastra PCR su un termociclatore.
- Impostare le condizioni di termociclo per la reazione WTB-PCR come segue: denaturazione iniziale a 95 °C per 6 min; 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 30 s, ricottura di primer a 56 °C per 30 s ed estensione a 72 °C per 1 min 20 s; estensione finale a 72 °C per 10 min.
nota: La migliore pratica prevede il completamento del resto del protocollo in un'area fisicamente separata per evitare la contaminazione da ampliconi nelle configurazioni future.