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1. Prepara le reazioni qPCR
NOTA: Una reazione PCR è per un campione. Ogni reazione di PCR contiene 5 μL di master mix qPCR (vedi materiali), 1 μL di miscela di coppie di primer da 5 μM, 2 μL di H2O e 2 μL di campione di fago T7 trattato termicamente. Per le reazioni PCR multiple, tutti i reagenti, ad eccezione del campione di fagi, vengono premiscelati in una provetta da 1,5 mL. Il volume di ciascun reagente nella premiscela dipende dal numero di campioni di fagi per la qPCR.
- Preparare la premiscela qPCR per 10 campioni di fagi biopannati di concentrazione sconosciuta e 7 campioni di concentrazioni standard in triplicato. Di conseguenza, ci sono 51 campioni totali e quindi 51 reazioni qPCR (cioè una reazione per campione). Per 51 reazioni, preparare una premiscela di 255 μl di master mix qPCR (51x 5 μl), 51 μl di primer (51x 1 μl) e 102 μl di H2O (51x 2 μl).
nota: Si consiglia di preparare alcune reazioni PCR extra per compensare la perdita di volume durante l'aliquotazione della miscela PCR in ciascun pozzetto della piastra qPCR a 96 pozzetti.
- Aliquotare 8 μL di premiscela PCR in ciascun pozzetto di piastra qPCR a 96 pozzetti per un totale di 51 pozzetti (ovvero 51 reazioni qPCR). Non è necessario modificare le punte durante l'aliquotazione.
- Aggiungere 2 μl di campioni di fagi T7 trattati termicamente o di DNA di riferimento del fago T7 a ciascun pozzetto (Figura 1B); cambiare le punte quando si aggiungono diversi campioni di DNA al pozzetto per evitare la contaminazione incrociata. Inoltre, dispensare i campioni di DNA da 2 μl sotto la superficie della premiscela qPCR (cioè nella premiscela PCR da 8 μl).
- Sigillare la piastra qPCR con pellicola adesiva.
nota: Questo passaggio è fondamentale, indipendentemente dal tipo di piastra qPCR. Utilizzare il kit consigliato per sigillare completamente la piastra; in caso contrario, qualsiasi regione non sigillata nella piastra causerà una perdita di volume durante il ciclo di PCR.
- Avvolgere la piastra qPCR con un foglio di alluminio per ridurre al minimo il fotosbiancamento a fluorescenza e procedere con l'esecuzione sull'apparecchiatura qPCR.
2. Condizioni di ciclo qPCR
NOTA: le condizioni di ciclo qPCR sono state impostate sull'apparecchiatura qPCR specifica.
- Eseguire la piastra qPCR a 96 pozzetti sull'apparecchiatura qPCR. Sull'apparecchiatura, selezionare le impostazioni dal menu per impostare le seguenti condizioni sperimentali (Figura 1C).
- Impostare le condizioni di ciclo come segue per un volume di campione di 10 μl: un ciclo a 50 °C per 2 minuti, un ciclo a 95 °C per 2 minuti, seguito da 40 cicli di (95 °C per 15 secondi, 60 °C per 1 minuto). Successivamente, eseguire le impostazioni della curva di fusione: un ciclo di 95°C per 15 s, 60°C per 1 min e 95°C 15 s.
- Procedere con l'analisi dei dati.
