$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. PCR asimmetrica per l'amplificazione di ssDNA
- Preparare una miscela di reagenti PCR asimmetrica per l'amplificazione dell'ssDNA da analizzare. Scongelare i reagenti della Tabella 1 con ghiaccio. Non conservare l'enzima polimerasi Taq (50 U/μL) sul ghiaccio, ma conservarlo a 20 °C fino al momento del bisogno.
- Agitare delicatamente tutti i reagenti e quindi centrifugare brevemente le provette a 10.000 x g per 10 s.
- Combinare tutti i reagenti come descritto nella Tabella 1.
- Posizionare i campioni in un termociclatore e avviare la PCR asimmetrica nelle seguenti condizioni: 25 cicli (95 °C per 30 s, 52 °C per 30 s e 72 °C per 30 s), 85 °C per 5 min, mantenere a 4 °C.
2. Microsfera-PCR per l'amplificazione dell'ssDNA
NOTA: Questa sezione descrive il protocollo per amplificare l'ssDNA in una provetta di reazione PCR. Le reazioni di microsfera-PCR sono state eseguite in 50 μL di volume di reazione. Le sequenze dettagliate utilizzate per amplificare l'ssDNA sono elencate nella Tabella 2. In questo caso, l'Ap sulla superficie delle microsfere può ritemprarsi in modelli di DNA casuali in modo complementare. Questo è un passaggio molto importante per la produzione di filamenti di DNA complementari (filamento di DNA antisenso, Figura 1). Il DNA esteso viene utilizzato come modello per l'amplificazione della microsfera-PCR.
- Preparare la miscela di reagenti microsfera-PCR. Scongelare i reagenti della Tabella 3 con ghiaccio; tuttavia, non mantenere l'enzima polimerasi Taq sul ghiaccio. Conservarlo a -20 °C fino al momento del bisogno.
- Agitare delicatamente tutti i reagenti e quindi centrifugare brevemente le provette a 10.000 x g per 10 s.
- Ottenere circa ~25 microsfere attraverso il conteggio microscopico.
nota: Il numero di microsfere in una provetta di reazione viene calcolato utilizzando un microscopio ottico con ingrandimento 40X. Circa ~25 microsfere vengono utilizzate per l'amplificazione della microsfera-PCR. Informazioni più dettagliate sono disponibili nel passaggio 3.
- Combinare tutti i reagenti come descritto nella Tabella 3.
- Posizionare i campioni in un termociclatore e avviare la PCR asimmetrica nelle seguenti condizioni: 25 cicli (95 °C per 30 s, 52 °C per 30 s e 72 °C per 30 s), 85 °C per 5 min, mantenere a 4 °C.
- Dopo l'amplificazione, aggiungere 8 μl di tampone di caricamento 6x e caricare 15 μl di ciascun campione in gel di agarosio al 2%. Quindi, eseguire l'elettroforesi a 100 V per 35 minuti in 1x tampone TAE (Tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8,2).
Tabella 1. Componenti della miscela di reagenti PCR asimmetrici in reazione da 20 μL.
forward
| Reagente | Volume per 1x reazione (μL) | Concentrazione finale |
| Modello di DNA casuale | 1 | 1 ng/μl |
| Primer per tag | 1 | 0,4 μM |
| Innesco inverso | 1 | 0,02 μM |
| Tampone Taq 10X | 5 | 1X |
| 10 mM di dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Acqua | 37,8 | - |
| totale | 50 | - |
Tabella 2. Informazioni sulla sequenza per Microsphere-PCR.
| sagoma | sequenza | Lunghezza (nt) |
| Modello di DNA casuale | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Sequenza casuale, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Primer Tag-Forward (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Innesco inverso | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tabella 3. Componenti della miscela di reagenti Microsphere-PCR in reazione da 50 μL
| Reagente | Volume per 1x reazione (μL) | Concentrazione finale |
| Ap-Microsfere | ~25 microsfere | - |
| Modello di DNA casuale | 1 | 1 ng/μl |
| Primer Tag-Forward | 1 | 0,4 μM |
| Tampone Taq 10X | 5 | 1X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Acqua | 37,8 | - |
| totale | 50 | - |
