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Articolo metodologico

Nested-PCR per rilevare una specifica sequenza genomica virale

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8 luglio 2025

In questo articolo

Abstract

Fonte: Feng, Y., et al. Valutazione di una reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa nidificata universale per la rilevazione di lyssavirus. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive la reazione a catena della polimerasi nidificata, una tecnica che consiste in due processi sequenziali di amplificazione PCR utilizzando due set di primer. Il primo set di primer è destinato alla ricottura delle sequenze a monte del secondo set, con conseguente amplificazione selettiva di specifiche sequenze geniche. Questa PCR è più sensibile e specifica di una normale PCR ed è ampiamente utilizzata come tecnica di rilevamento per varie malattie.

Protocollo

1. Trascrizione inversa dell'RNA virale

  1. Rimuovere i reagenti RT elencati nella Tabella 1 dal congelatore, tenerli in ghiaccio, scongelarli e agitarli prima dell'uso.
  2. Preparare 12 μl di miscela di reazione RT in una provetta PCR da 0,2 mL con i reagenti elencati nella Tabella 1. Consentire le variazioni di pipettaggio preparando un volume della miscela master di almeno una dimensione di reazione superiore a quello richiesto.
  3. Aggiungere 8 μL di campione, RNA di controllo positivo o controllo negativo alla miscela di reazione RT all'interno di una workstation PCR in una sala modelli. Il controllo RT positi....

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ddH2Odiversodiverso
dNTP (10 mM)TakaraOre 4019
dNTP (2,5 mM)TakaraCodice: 4030
Ex-Taq (5 U/μL)TakaraRR001
Provette per microcentrifugadiversodiverso
Trascrittasi inversa M-MLV (200 UI/μL)TakaraCodice 2641A
Oligo (dT)15Takara3805
Macchina per PCRBIO-RADT100
Provette per PCRdiversodiverso
Pipettatoridiversodiverso
Primer casualeTakara3801
Inibitore della RNasi (40 UI/μL)TakaraCodice 2313A
ddH2O senza RNasiTakaraCodice 9102
Tampone Taq (10x)Takara9152A
Suggerimentidiversodiverso
Miscelatore a vorticediversodiverso

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