1. Trascrizione inversa dell'RNA virale
- Rimuovere i reagenti RT elencati nella Tabella 1 dal congelatore, tenerli in ghiaccio, scongelarli e agitarli prima dell'uso.
- Preparare 12 μl di miscela di reazione RT in una provetta PCR da 0,2 mL con i reagenti elencati nella Tabella 1. Consentire le variazioni di pipettaggio preparando un volume della miscela master di almeno una dimensione di reazione superiore a quello richiesto.
- Aggiungere 8 μL di campione, RNA di controllo positivo o controllo negativo alla miscela di reazione RT all'interno di una workstation PCR in una sala modelli. Il controllo RT positivo è l'RNA estratto dalla coltura cellulare infettata con il ceppo fisso di RABV CVS-11 (challenge virus standard-11) e conservato a -80°C. Il controllo negativo contiene ddH2O privo di RNasi.
- Miscelare il contenuto delle provette RT mediante vertice, quindi centrifugare brevemente.
- Caricare i tubi di reazione in un termociclatore. Impostare il programma di sintesi del cDNA con le seguenti condizioni: 42°C per 90 min, 95°C per 5 min e 4°C in attesa. Impostare il volume di reazione su 20 μl. Avviare la corsa RT.
2. Prima fase di PCR
- Conservare i reagenti PCR elencati nella Tabella 2 sul ghiaccio in una camera bianca fino all'uso; quindi, scongelarli e agitarli.
- Preparare la prima miscela per PCR in una provetta per PCR da 0,2 mL con i reagenti elencati nella Tabella 2.
- Aggiungere un campione da 2 μL di cDNA o plasmide nella miscela PCR del primo ciclo all'interno di una workstation PCR in una sala modelli. Il controllo positivo per PCR è il cDNA CVS-11 preparato come menzionato nel passaggio 1.3 per il metodo RT di cui sopra. Il controllo negativo della PCR è dd H2O.
- Trasferire le provette sigillate in un termociclatore per PCR e ciclare utilizzando i parametri elencati nella Tabella 3.
3. PCR del secondo ciclo
- Preparare la miscela per PCR del secondo ciclo in una provetta per PCR da 0,2 mL utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 4.
- Aggiungere 2 μl del prodotto PCR del primo ciclo nella miscela PCR del secondo ciclo. Inoltre, includere dd H2O come controllo negativo del secondo ciclo di PCR.
- Eseguire i cicli termici PCR utilizzando gli stessi parametri indicati al punto 2.4.
Tabella 1: Reagenti di trascrizione inversa per la sintesi del cDNA.
| componente | Volume per reazione (μl) |
| dNTP (2,5 mM ) | 4 |
| Primer casuale (50 μM) | 1.5 |
| Oligo(dT) 15 (50 μM) | 0,5 |
| Tampone M-MLV (5x) | 4 |
| Trascrittasi inversa M-MLV (200 UI/μL) | 1 |
| RNasina (40 UI/μL) | 1 |
| Volume totale | 12 |
Tabella 2: Reagenti del primo ciclo di PCR.
| componente | Volume per reazione (μl) |
| dNTP (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampone Taq (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39,7 |
| Volume totale | 48 |
Tabella 3: Parametri ciclici del primo e del secondo ciclo di PCR
| temperatura | Ore | ciclo |
| 94 °C | 2 minuti | 1 |
| 94 °C | 30 secondi | 35 |
| 56 °C | 30 secondi | 35 |
| 72 °C | Anni '40 | 35 |
| 72 °C | 10 minuti | 1 |
| 4 °C | ∞ | |
Tabella 4: Reagenti del secondo ciclo di PCR.
| componente | Volume per reazione (μl) |
| dNTP (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampone Taq (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39,7 |
| Volume totale | 48 |