PCR di fusione ad alta risoluzione per determinare le variazioni di sequenza nelle sequenze di DNA mutanti

Abstract

Fonte: Kisserli, A., et al. PCR di fusione ad alta risoluzione per la genotipizzazione del polimorfismo di lunghezza del recettore del complemento 1: uno strumento innovativo per la valutazione della suscettibilità genica della malattia di Alzheimer. J. Vis. Exp. (2017).

In questo video, descriviamo una tecnica di PCR di fusione ad alta risoluzione per determinare il polimorfismo di lunghezza di frammenti di DNA di varie lunghezze di sequenza, in base all'analisi della temperatura di fusione.

Protocollo

1. Protocollo HRM-PCR

1. Scongelare i campioni di DNA. Diluire i campioni di DNA in provette da 1,5 mL con acqua per regolarli a una concentrazione di 10 ng/μL
   nota: Il volume totale di DNA diluito deve essere compreso tra 2 μl e 10 μl.
2. Scongelare le soluzioni di primer. Diluire le soluzioni di primer in provette da 1,5 mL con acqua per regolarle alla stessa concentrazione di 6 μM.
   nota: Le sequenze di primer e le condizioni di reazione sono fornite nella Tabella 1.
3. Scongelare le soluzioni del kit HRM-PCR e miscelare accuratamente a vortice per garantire il recupero di tutto il contenuto. Centrifugare brevemente le tre fiale contenenti la miscela enzimatica con il colorante legante il DNA, MgCl₂ e acqua in una microcentrifuga prima di aprirle. Conservateli a temperatura ambiente.
4. In una provetta da 1,5 mL a temperatura ambiente, preparare la miscela PCR per una reazione da 20 μL aggiungendo i seguenti componenti nell'ordine elencato di seguito:
   1. 10 μL di miscela enzimatica con colorante legante il DNA;
   2. 2 μL di 25 mM di MgCl₂;
   3. 1 μL di primer 1,6 μM (concentrazione finale: 300 nM);
   4. 1 μl di primer 2, 6 μM (concentrazione finale: 300 nM); e
   5. 5 μL di acqua.
      nota: Per preparare la miscela PCR per più di una reazione, moltiplicare i volumi di cui sopra per il numero di reazioni da eseguire, più una reazione aggiuntiva.
5. Mescolare accuratamente a vortice.
6. Pipettare 19 μl di miscela per PCR, preparata sopra, in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto bianca.
7. Aggiungere 1 μL di modello di DNA aggiustato per la concentrazione.
   nota: Per le reazioni di controllo, eseguire sempre un controllo negativo con i campioni. Per preparare un controllo negativo, sostituire il DNA stampo con acqua.
8. Sigillare la piastra multipozzetto bianca con un foglio sigillante.
9. Posizionare la piastra multipozzetto bianca nella centrifuga e bilanciarla con un contrappeso adatto (cioè un'altra piastra multipozzetto). Centrifugare per 1 minuto a 1.500 x g in una centrifuga standard a secchiello oscillante contenente un rotore per piastre multipozzetto con adattatori adeguati.
10. Caricare la piastra multipozzetto bianca nello strumento HRM-PCR.
11. Avviare il programma HRM-PCR con le seguenti condizioni PCR:
    Denaturazione: 95 °C per 10 min; 1 ciclo.
    Amplificazione: 95 °C per 10 s, 62 °C per 15 s e 72 °C per 20 s; 47 cicli.
    Curva di fusione: 95 °C; velocità di rampa: 0,02 °C/s; 25 acquisizioni per °C; 1 ciclo.
    Raffreddamento: 40 °C per 30 s; velocità di rampa 2,2 °C/s; 1 ciclo.

Tabella 1: Primer e parametri utilizzati nell'analisi di fusione ad alta risoluzione.

2. Analisi HRM per determinare il polimorfismo di lunghezza CR1

NOTA: La metodologia descritta (Figura 1) è specifica per il nostro software (Vedi la Tabella dei Materiali), sebbene possano essere utilizzati altri pacchetti software.

1. Aprire un software di scansione genica per eseguire l'analisi di scansione del polimorfismo di lunghezza CR1.
2. Aprire l'esperimento contenente il programma di amplificazione e il programma della curva di fusione.
3. Fare clic su Editor di campioni nella barra dei moduli, quindi selezionare il flusso di lavoro di scansione.
4. Definire le proprietà dei campioni (ad esempio, nome; controllo sconosciuto o negativo).
5. Fare clic su Analisi nella barra dei moduli.
6. Nell'elenco Crea nuova analisi, selezionare Scansione genetica.
7. Fare clic sulla scheda Normalizzazione per normalizzare le curve di fusione.
8. Fare clic sulla scheda Spostamento temperatura per reimpostare l'asse della temperatura (asse x) delle curve di fusione.
   nota: Il grafico inferiore mostra le curve di fusione che sono sia normalizzate che spostate in temperatura.
9. Fare clic sul pulsante Calcola per analizzare i risultati e determinare il raggruppamento.
10. Fare clic sulla scheda Grafico differenze nell'area dei grafici per visualizzare le curve di fusione normalizzate e spostate e il grafico delle differenze normalizzate e spostate in temperatura.

Risultati

Figura 1: Screenshot dell'interfaccia grafica del software utilizzato nel passaggio 2 del protocollo. (A) Aprire il software di scansione genetica. (B) Programma di amplificazione e programma della curva di fusione. (C) Fare clic su Editor di esempi nella barra dei moduli. (D) Selezionare Scansione. (E)

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Camice			protezione
Guanti da esame in nitrile senza polvere SensiCareIce	Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, Stati Uniti	486802	Protezione del campione
Pipetta Eppendorf Reference 2, 0,5-10μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	4920000024	pipettaggio di campioni
Pipetta Eppendorf Reference 2, 20-100μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	4920000059	pipettaggio di campioni
Pipetta Eppendorf Reference 2, 100-1000μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	4920000083	pipettaggio di campioni
TipOne 10μL Graduato, puntale con filtro	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germania	S1121-3810	pipettaggio di campioni
TipOne 1-100μL smussato, puntale con filtro	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germania	S1120-1840	pipettaggio di campioni
Punta barriera ART 1000E	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia	2079E	pipettaggio di campioni
Provette Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, qualità Eppendorf	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	30120086	mescolare
Vortice-Genio 2	Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, Stati Uniti	SI-0236	mescolare
Centrifuga Mikro 200	Hettich Zentrifugen, D-78532, Germania	0002020-02-00	centrifugazione
Multipette E3	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	4987000010	distribuzione
Light Cycler 480 piastra multipozzetto 96, bianco	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germania	4729692001	luogo di reazione
Foglio sigillante Light Cycler 480	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germania	4429757001	copertura
LightCycler 480 Instrument II, 96 pozzetti	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germania	05015278001	Reazione a catena della polimerasi di fusione ad alta risoluzione
Centrifuga Heraeus Megafuge 11R	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia	75004412	centrifugazione
LightCycler 480 Master di fusione ad alta risoluzione	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germania	04909631001	reagenti di reazione
Primer CN3: 5'ggccttagacttctcctgc 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgio		reagente di reazione
Primer CN3re: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgio		reagenti di reazione
software light cycler 480 SW 1.5.1	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germania		software utilizzato per l'analisi dei dati di polimorfismo HRM-PCR CR1