Reazione a catena della polimerasi Multiplex Droplet per rilevare la metilazione del DNA nei leucociti

Abstract

Fonte: Malic, L., et al. Metilazione Multiplex Multiplex Droplet PCR utilizzando un dispositivo generatore di goccioline polimeriche per la diagnostica ematologica.J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra la tecnica di reazione a catena della polimerasi a goccioline multiplex per la quantificazione simultanea di regioni di DNA metilato in diverse popolazioni di globuli bianchi come biomarcatore precoce per la diagnosi clinica e la prognosi.

Protocollo

1. Generazione di goccioline e PCR

NOTA: La Tabella 1 delinea le informazioni sui primer diretti e inversi insieme alle sonde di idrolisi a doppia tempra per i geni C-LESS, CD3Z e Foxp3, che sono necessari per l'amplificazione multiplex di bersagli genici demetilati.

1. Preparare la miscela master come descritto nella Tabella 2.
2. Scongelare tutti i componenti della miscela master, ad eccezione della miscela enzimatica. Miscelare accuratamente la miscela master pipettandola verso l'alto verso il basso e centrifugare brevemente.
3. Aggiungere il volume appropriato (1 μl) di DNA convertito con bisolfito alla miscela master in una provetta per PCR. Miscelare la reazione pipettando verso l'alto verso il basso e centrifugare brevemente.
4. Collegare il tubo fluidico monouso (diametro interno 0,25 mm, diametro esterno 1,6 mm) a due siringhe di vetro di precisione (volume 250 μl) utilizzando raccordi in PEEK.
5. Preriempire una siringa di vetro di precisione con 250 μL di olio vettore contenente il 5% di fluoro-tensioattivo.
6. Preriempire un'altra siringa di vetro di precisione con 50 μL di olio vettore prima di caricare 100 μL della miscela PCR per garantire l'erogazione dell'intero volume del campione durante l'emulsione.
7. Installa un dispositivo microfluidico a goccioline su un tavolino di un microscopio ottico verticale dotato di una fotocamera ad alta velocità per osservare e registrare la formazione di goccioline in tempo reale.
8. Posizionare le siringhe preriempite sulla pompa-siringa programmabile e, utilizzando il raccordo in PEEK con raccordi (vedere la tabella dei materiali), collegare il tubo delle siringhe al tubo dei rispettivi canali di ingresso del dispositivo microfluidico a goccioline.
9. Posizionare il tubo dall'uscita del generatore di gocce all'interno di una provetta PCR da 0,5 mL.
10. Regolare la portata della pompa a siringa a 2 μL/min e lasciare che la dimensione delle gocce si stabilizzi prima di raccogliere l'emulsione risultante.
11. Raccogliere l'emulsione e trasferire 75 μl in una provetta PCR da 0,2 mL per il ciclo termico.
12. Assicurarsi che il contenuto di olio nella provetta per PCR corrisponda strettamente al volume della fase dispersa per evitare la coalescenza delle goccioline durante il ciclo termico.
13. Posizionare la provetta PCR da 0,2 mL in un termociclatore ed eseguire il protocollo ciclico come segue: preriscaldamento a 95 °C per 5 minuti, quindi 45 cicli di denaturazione a 95 °C per 15 s e ricottura/estensione a 60 °C per 30 s.

Tabella 1: Progettazione del primer e della sonda di idrolisi.

FOXP3 Avanti	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
FOXP3 Inverso	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
CD3Z in avanti	GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG
CD3Z Inverso	CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA
C-LESS Forward	TTG TAT GTA TGT GAG TGT AGA GA
C-LESS Inverso	TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C
Sonda FOXP3	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
Sonda CDZ3	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
Sonda C-Less	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

Tabella 2: Ricetta master mix per mdPCR.

Reagente	Soluzione madre	Volume Master Mix	Concentrazione lavorativa
Tris-HCl	1 M	2 μl	20 mM
Kcl	1 M	10 μl	100 mM
MgCl2	25 mM	16 μl	4 mM
Inneschi C-LESS	10 μM	10 μl	1 μM ciascuno
Primer CD3Z	10 μM	10 μl	1 μM ciascuno
Inneschi FOXP3	10 μM	10 μl	1 μM ciascuno
Sonda C-LESS	10 μM	5 μl	500 nM
Sonda CD3Z	10 μM	5 μl	500 nM
Sonda FOXP3	10 μM	5 μl	500 nM
HotStarTaq DNA polimerasi	5 Unità/μL	8 μl	0,4 unità/μl
Bersaglio DNA trattato con bisolfite	variabile	variabile	variabile
Acqua priva di nucleasi		variabile
Volume totale		100 μl

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta per PCR	Bio-Rad, Mississauga, Ontario	TFI0201
Fluoro-tensioattivo	RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroTensioattivo
Tubo fluidico monouso	dolomite	3200063
Tubo fluidico monouso	dolomite	3200302
Raccordi in PEEK	IDEX Salute e Scienza, Oak Harbor, WA	P-881
Olio vettore	3M, San Paolo, MN
Microscopio ottico verticale	Nikon, Melville, NY