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1. Controllo di qualità del DNA genomico
NOTA: Il DNA genomico (gDNA) è stato estratto dal sangue periferico utilizzando il metodo di purificazione del DNA basato sulla membrana di silice. Prima delle seguenti procedure, la concentrazione di gDNA è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro.
- Preparare il campione di gDNA a una concentrazione di 10-100 ng/μL.
- Aggiungere 10 μl di tampone per campioni di DNA a una striscia da 8 provette.
- Aggiungere 1 μL di DNA ladder o gDNA alle provette. Agitare il composto per 1 minuto utilizzando l'accessorio per micropiastra.
- Caricare la provetta, il dispositivo gel e i puntali delle pipette nello strumento per elettroforesi (Tabella dei materiali) e avviare la corsa premendo il pulsante "Start".
nota: Il sistema di elettroforesi funzionerà automaticamente con un clic sul pulsante Start.
- Verificare che il marcatore inferiore contenuto nel tampone del campione di DNA sia assegnato correttamente sugli elettroferogrammi. Se è assegnato in modo errato, assegnare manualmente il marcatore nella 'Modalità elettroerogramma' del software.
nota: Il numero di integrità del DNA (DIN) verrà calcolato automaticamente. Il valore DIN deriva dall'integrità del DNA. Valori DIN alti e bassi indicano rispettivamente gDNA altamente intatto e fortemente degradato.
- Specificare la regione di dimensione del gDNA (> 200 bp) nella "Modalità regione" del software per calcolare automaticamente la concentrazione di gDNA (> 200 bp).
2. Primer e progettazione della sonda
- Calcolare i valori della temperatura di fusione (Tm) utilizzando qualsiasi strumento ad accesso aperto nelle seguenti condizioni: 10-25 basi, 50 mM Na+/K+, 0,80 mM dNTP e 3 mM Mg2+ (Tabella dei materiali). Progettare i primer diretti e inversi per amplificare la regione genomica contenente alleli bersaglio con il valore Tm intorno a 60 °C e la lunghezza dell'amplicone a 100-300 bp.
NOTA: Fare riferimento alla Tabella 1 per la concentrazione di oligonucleotidi.
- Progettare le sonde di acido nucleico bloccato (LNA) per gli alleli di riferimento e varianti in base alle seguenti condizioni: (i) in ciascuna sonda sono presenti 1-6 LNA; (ii) un colorante fluorescente e un quencher sono presenti rispettivamente alle estremità 5' e 3' di ciascuna sonda; iii) la differenza tra i valori di Tm delle sonde abbinate e non corrispondenti è > 10 °C; (iv) I valori di Tm delle sonde abbinate e non corrispondenti sono rispettivamente superiori e inferiori a quelli dei primer [ad esempio, primer diretto: 60,8 °C, primer inverso: 59,8 °C, sonda allelica di riferimento (abbinata/non corrispondente): 62,6/45,3 °C, sonda allelica variante (abbinata/non corrispondente): 61,7/50,5 °C]. I valori di Tm sono stati calcolati utilizzando lo strumento di accesso aperto utilizzato anche per il passaggio 2.1.
- Assicurarsi che i primer e le sonde progettati non includano i polimorfismi a singolo nucleotide con una frequenza di > 0,1% come determinato dai database [ad esempio, il database dei polimorfismi a singolo nucleotide (dbSNP)].
3. PCR digitale
- Preparare i primer, le sonde e le soluzioni madre di gDNA alle concentrazioni descritte nella Tabella 1 con un tampone TE e conservarli a -20-4 °C.
- Miscelare i reagenti a temperatura ambiente in un volume totale di 15 μl fino a una concentrazione finale come descritto nella tabella 1.
- Aggiungere 3 μL di acqua distillata al posto del gDNA in un controllo senza stampo (NTC).
- Preparare 3,5 volte la quantità di miscela PCR in triplice copia per tenere conto dell'errore di pipettaggio.
- Pipettare la miscela PCR su e giù per mescolarla.
- Posizionare la piattaforma di carico sui trucioli incorporati nella striscia a 8 tubi e posizionarli sul caricatore automatico. Assicurarsi che ci sia contatto tra il truciolo e la piattaforma di carico.
- Montare un cursore di carico sulla piattaforma e tenere il cursore con il fermo lontano dal caricatore.
- Pipettare 15 μl della miscela PCR sulla piattaforma vicino alla punta del cursore (Figura 1A).
- Far funzionare il caricatore premendo il pulsante del caricatore (per circa 1 minuto).
nota: Non è un problema se sulla piattaforma rimane una piccola quantità di miscela PCR. È possibile eseguire nuovamente il caricatore in sequenza.
- Posizionare il chip-in-a-tube riempito con la miscela PCR nella fessura laterale del potenziatore di tenuta. Spingere il coperchio scorrevole e il bordo del coperchio superiore per non rompere il chip (Figura 1B).
- Azionare il potenziatore di tenuta (circa 2 minuti). Ripetere in sequenza il potenziatore di sigillatura per 1 minuto se una pozzanghera di liquido è ancora visibile perché una sigillatura incompleta provoca la contaminazione incrociata dei segnali positivi (Figure 1C e 1D).
- Aggiungere 230 μl di liquido sigillante, un reagente a base di olio, alle provette.
nota: I trucioli dovrebbero ora essere immersi nel fluido.
- Inserire i tubi nel termociclatore. Far funzionare il termociclatore come descritto nella Tabella 2 (per circa 2 ore). Regolare la temperatura o la durata della PCR se c'è una distribuzione irregolare delle partizioni positive (Figura 1E).
NOTA: Si consiglia di impostare la velocità di rampa a circa 1 °C/s.
- Lasciare i tubi nel termociclatore per almeno 15 minuti per ridurre il rumore di base.
nota: I tubi possono essere lasciati anche durante la notte. I segnali di fluorescenza sono stati rilevati anche il giorno successivo.
- Posizionare le provette sulla maschera di rilevamento e versare 6 ml di acqua distillata nella maschera. Se sono visibili bolle d'aria all'interno e all'esterno dei tubi, eliminarle (Figure 1F e 1G).
- Caricare la maschera nel rivelatore ed eseguirla con un clic sul pulsante 'Esegui' del software dopo aver selezionato le schede Fluorescenza, Esperimento e Campione/NTC (Tabella dei materiali).
NOTA: Il rilevamento a doppio colore di otto campioni con un'intensità predefinita richiede circa 4 - 5 minuti.
- Confermare il grafico di posizione, l'istogramma e il grafico a dispersione 2D.
NOTA: Se l'intensità della fluorescenza delle partizioni negative è elevata, regolare l'intensità con un clic sul pulsante Impostazioni del software in modo che rientri nell'intervallo 30-70.
- Calcola la frazione allelica variante (VAF) utilizzando la seguente formula:
Qui, Cv e Cr sono rispettivamente il numero di copie della variante e l'allele di riferimento.
nota: Vengono calcolati automaticamente nel programma software in base alle statistiche di Poisson.
4. Raccolta del prodotto PCR
- Rimuovere il liquido sigillante dal tubo.
- Aggiungere 100 μl di tampone TE alla provetta. Agitare energicamente per 30 s e centrifugare brevemente la provetta.
- Trasferire la soluzione di TE in un'altra provetta e aggiungere 30 μl di acetato di sodio 3 M e 200 μl di etanolo.
- Raffreddare la soluzione a -20 °C per una notte.
- Centrifugare la soluzione per 30 minuti a 16.000 x g e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 300 μl di etanolo all'80% alla provetta e vortice.
- Centrifugare la soluzione per 15 minuti a 16.000 x g e rimuovere il surnatante. Lasciare asciugare il precipitato all'aria per 5 minuti.
- Sciogliere il precipitato in 1-5 μl di tampone TE dopo l'essiccazione all'aria.
- Se necessario, valutare la pezzatura del prodotto utilizzando uno strumento di elettroforesi con riferimento alla fase 1. Caricare 1 μL della soluzione nel dispositivo in gel per un'elevata sensibilità (Tabella dei materiali).
