PCR digitale basata su chip per rilevare rare varianti di trascritto utilizzando un chip nanofluidico

Abstract

Fonte: Molinari, C., et al. Rilevamento di una rara variante di trascrizione CDH1 nei tessuti di cancro gastrico congelati freschi mediante PCR digitale basata su chip. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra la PCR digitale basata su chip, una variante della tecnica PCR digitale utile per rilevare rare varianti di trascrizione. La reazione PCR è suddivisa nelle camere di un chip nanofluidico, ognuna delle quali agisce come una reazione indipendente. La rilevazione di segnali di fluorescenza provenienti dalle camere con bersagli amplificati conferma la presenza di rare varianti di trascrizione nel campione.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

NOTA: Questa procedura è specificamente progettata per la rilevazione di un basso numero di molecole di cDNA in tessuti umani freschi congelati. Le sezioni di tessuto sono state tagliate su ghiaccio secco, mentre erano ancora congelate, da campioni di tumore gastrico derivato da pazienti precedentemente convalidati o da campioni di tessuto normale.

1. Isolamento e purificazione dell'RNA

1. Estrazione dell'RNA
   nota: L'isolamento dell'RNA viene eseguito sotto il cofano utilizzando un prodotto specifico (vedi Tabella dei materiali). Tuttavia, in commercio è disponibile una varietà di kit di isolamento.
   1. Omogeneizzare 50 - 100 mg di un campione di tessuto fresco congelato finemente tagliato in una provetta da 1,5 mL con 1 mL di reagente di isolamento dell'RNA e agitare energicamente per 15 s. Incubare le provette a -80 °C per una notte.
   2. Incubare la provetta contenente il campione a temperatura ambiente per 5 minuti e mescolare agitando per 15 s.
   3. Tenere la provetta in ghiaccio, aggiungere 200 μL di cloroformio e agitare energicamente per 15 s.
   4. Incubare le provette a temperatura ambiente per 60 s e centrifugarle a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
   5. Trasferire la fase acquosa in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 20 μg di glicogeno.
      nota: È importante evitare accuratamente di trasferire gli strati di interfase o organici per ridurre la contaminazione.
   6. Aggiungere 500 μl di isopropanolo, capovolgendo la provetta per mescolare, e incubare su ghiaccio per 10 minuti.
   7. Centrifugare la provetta a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C per precipitare RNA.
      nota: L'RNA sarà presente in un pellet gelatinoso sul lato e sul fondo della provetta, spesso invisibile dopo la centrifugazione.
   8. Rimuovere il surnatante senza disturbare il precipitato e lavarlo con 1 mL di etanolo al 75% mediante pipettaggio.
   9. Centrifugare la provetta a 7.500 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
   10. Lasciare asciugare il pellet fino a quando il precipitato diventa trasparente e scioglierlo in 50 μL di acqua priva di RNasi.
   11. Congelare i campioni a -80 °C almeno una notte prima della quantificazione.
2. Eliminazione genomica del DNA e purificazione dell'RNA
   nota: Una fase di digestione della DNasi, seguita da una purificazione dell'RNA basata su colonna, è raccomandata per l'analisi di bersagli a bassa abbondanza al fine di digerire il DNA contaminante.
   1. Sciogliere la DNasi I liofilizzata (1.500 unità Kunetty) in 550 μL di acqua priva di RNasi utilizzando una siringa, mescolare delicatamente capovolgendo il flaconcino e dividere la soluzione madre ricostituita in aliquote.
   2. Trasferire in una provetta da 1,5 mL il volume calcolato del campione con 15 μg di RNA, 10 μL di tampone per la digestione della DNasi dal kit (elencato nella Tabella dei materiali), 2,5 μL di soluzione madre di DNasi I e acqua priva di RNasi a 100 μL. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
   3. Aggiungere 350 μl di tampone per lisi tissutale (dal kit, vedere la Tabella dei materiali) e miscelare mediante pipettaggio.
   4. Aggiungere 250 μl di etanolo al 100% e miscelare mediante pipettaggio.
   5. Trasferire l'intero volume (700 μl) in una nuova colonna di centrifugazione e centrifugare a 12.000 x g per 15 s.
   6. Trasferire il filtro in una nuova provetta di raccolta, aggiungere 500 μl di etanolo all'80% alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti.
   7. Aprire il coperchio della colonna centrifuga e centrifugare a 12.000 x g per 5 minuti con una nuova provetta di raccolta per asciugare il filtro; quindi trasferire il filtro in una provetta da 1,5 mL.
   8. Aggiungere 14 μL di acqua priva di RNasi direttamente nella colonna filtrante e centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto.
   9. Conservare i campioni in ghiaccio e procedere alla quantificazione utilizzando 2 μL di campione su uno spettrofotometro da banco o conservare l'RNA a -80 °C fino al momento dell'uso.

2. Configurazione della reazione alla PCR digitale

1. Miscela di reazione dPCR e preparazione del campione
   1. Scongelare la miscela master e il saggio a temperatura ambiente per almeno 20 minuti.
   2. Diluire i campioni di cDNA a una concentrazione di 300 ng in 6 μL di acqua.
   3. Agitare delicatamente la miscela master e preparare la miscela in una provetta sterile con 8,7 μl di master mix, 0,87 μl del primer per saggio CDH1a progettato su misura e 1,83 μl di acqua priva di nucleasi per un volume finale di 11,4 μl.
      nota: Per i dettagli del primer del saggio CDH1a progettato su misura, vedere la Tabella dei materiali.
   4. Trasferire 11,4 μl della miscela preparata nel campione di cDNA diluito, miscelare delicatamente e centrifugare brevemente.
      nota: I volumi includono il 20% in eccesso per compensare la perdita di volume dovuta al pipettaggio. Preparare la miscela per tutti i campioni e un controllo senza modello (NTC).
2. Preparazione trucioli
   Nota: per risultati ottimali, caricare i chip il prima possibile.
   1. Collegare il caricatore di trucioli e attendere che la spia diventi verde.
   2. Rimuovere il tappo della siringa del fluido da immersione tirando delicatamente indietro lo stantuffo di 1 - 2 mm e rilasciandolo per facilitare questo passaggio, quindi sostituirlo con una punta.
   3. Prendi un nuovo chip e prendi nota del codice scritto sul coperchio per associarlo al campione.
   4. Tenere delicatamente il coperchio per il lato, staccare la pellicola protettiva e posizionare il coperchio con la faccia adesiva rivolta verso l'alto nell'orientamento corretto.
   5. Prelevare con cautela un truciolo, facendo attenzione a non toccare la parte interna, e caricarlo sul nido di trucioli nella posizione corretta premendo la leva per aprire il morsetto.
   6. Caricare una nuova lama di caricamento sul caricatore e spingerla delicatamente per assicurarsi che sia saldamente in posizione.
   7. Trasferire 14,5 μl della miscela di reazione dPCR sulla lama di caricamento senza formare bolle d'aria o deviare la lama, dopodiché premere il pulsante di caricamento nero per distribuire il volume sul chip.
   8. Utilizzare la siringa del fluido da immersione per trasferire circa 20 gocce sulla superficie del truciolo facendo attenzione a non toccare la superficie con la punta.
      nota: È importante coprire l'intera superficie senza versare liquidi sui bordi.
   9. Ruotare il braccio del caricatore per fare in modo che il coperchio entri in contatto con il truciolo e premere per 15 s.
   10. Premere il pulsante del coperchio per rilasciare il chip e riportare il braccio nella sua posizione.
   11. Tenere il chip assemblato a un angolo di 45° ed erogare con cura il fluido di immersione con la siringa attraverso la porta di riempimento, ruotare leggermente il chip per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria e rimuovere il liquido in eccesso con un panno sterile.
   12. Sigillare la custodia dei chip staccando delicatamente l'etichetta sulla parte superiore del coperchio dei chip e premere sulla porta di riempimento per almeno 5 s.
   13. Conservare il chip al buio fino al momento di essere caricato nel termociclatore.
       nota: Le patatine preparate devono essere utilizzate entro 2 ore.
3. Reazione dPCR
   1. Aprire il coperchio e installare gli adattatori su entrambi i blocchi, anche quando si utilizza un singolo blocco.
   2. Posizionare i chip sul blocco campione nella posizione corretta.
      nota: La porta di riempimento deve essere orientata verso la parte anteriore del termociclatore in una posizione rialzata per consentire alle bolle d'aria di galleggiare verso l'alto senza disturbare la finestra del chip. Usa le fiches vuote per bilanciare i due blocchi.
   3. Appoggiare il pad termico sul blocco campione per coprire completamente i chip.
   4. Chiudere il coperchio e iniziare l'esecuzione della PCR, applicando le seguenti condizioni: mantenere a 96 °C per 10 min; 45 cicli a 60 °C per 2 min e 98 °C per 30 s; tenere a 60 °C per 2 min; tenere a 4 °C. Spegnere il termociclatore e scongelare i chip a temperatura ambiente per almeno 10 min.
      nota: L'analisi del truciolo deve essere eseguita entro un'ora.
4. Analisi del chip
   1. Aprire il coperchio dello strumento e rimuovere i pad termici, quindi rimuovere i chip dagli adattatori.
      nota: Conservare i chip in un luogo buio e pulito fino all'analisi.
   2. Pulire la superficie del truciolo con isopropanolo e un panno sterile.
      nota: Ispeziona ogni chip per verificare la presenza di perdite o potenziali problemi.
   3. Inserire l'USB nel sistema di rilevamento per salvare i dati.
   4. Aprire il vassoio dei trucioli del sistema di rilevamento, caricare il chip a faccia in su nella posizione corretta, quindi chiudere il vassoio.
   5. Attendere 30 s per l'elaborazione, quindi rimuovere il chip e inserire quello successivo.
   6. Attendi il completamento dell'analisi per tutti i chip elaborati, quindi inserisci l'USB in un computer per trasferire i file.
      nota: Il tempo totale per l'analisi è di circa 2 o 3 minuti/chip.

3. Analisi e interpretazione dei dati

1. Connettiti alla piattaforma software basata su cloud necessaria per eseguire tutte le analisi a valle.
2. Crea un progetto e importa tutti i file di dati dei chip di interesse.
3. Inserire il nome del campione; selezionare il colorante e il saggio utilizzati nella scheda "Definisci chip".
4. Determinare se il chip è accettabile visualizzandolo nella scheda "Review Data", controllando la precisione con cui il campione è stato caricato sul chip e quanti punti dati sono valutabili.
   nota: Rifiuta i chip con meno di 13.000 punti dati valutabili.
5. Passa al grafico a dispersione del chip selezionato sul lato destro dello schermo; applica una soglia di 6.000 per i segnali di colorante reporter della fluoresceina amidite (FAM) (asse Y) a tutti i chip.
   nota: L'impostazione della soglia può variare in base ai saggi utilizzati.
6. Rimuovi qualsiasi segnale positivo dubbio per evitare risultati falsi positivi selezionando il punto relativo sul grafico a dispersione utilizzando lo strumento lazo e premendo su "indeterminato". Tutti i restanti punti positivi indicano la presenza di copie di cDNA del raro bersaglio analizzato.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente TRIazol	Thermo Fisher Scientifico	15596018
Glicogeno 20 mg/ml	Roche	10901393001
RNeasy MinElute Kit di pulizia	QIAGEN	Codice: 74204
Kit di sintesi iScript cDNA	BioRad	1708891
QuantStudio 3D PCR digitale Master Mix v2	Thermo Fisher Scientifico	Codice A26358
CDH1a IDT test progettato su misura	Tecnologie integrate del DNA (IDT)	Na	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [concentrazioni di test ottimizzate per dPCR: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)]
Kit chip QuantStudio 3D Digital PCR 20K v2	Thermo Fisher Scientifico	Codice A26316
Affresco della Biofuga di Heraeus	Termo Scientifico	75002402
Termociclatore (Labcycler)	Sensoquest	011-103
Sistema PCR GeneAmp 9700	Thermo Fisher Scientifico	N805-0200
Modulo di campionamento a doppio blocco piatto	Thermo Fisher Scientifico	4425757
Base inclinabile QuantStudio 3D per sistema PCR GeneAmp 9700 a doppio blocco piatto	Thermo Fisher Scientifico	4486414
Kit adattatore per chip PCR digitale 3D QuantStudio per termociclatore a blocco piatto	Thermo Fisher Scientifico	4485513
Caricatore di chip PCR digitale QuantStudio 3D	Thermo Fisher Scientifico	4482592
Strumento PCR digitale 3D QuantStudio con cavo di alimentazione	Thermo Fisher Scientifico	4489084