PCR digitale basata su chip per rilevare rare varianti di trascritto utilizzando un chip nanofluidico

Abstract

Fonte: Molinari, C., et al. Rilevamento di una rara variante di trascrizione CDH1 nei tessuti di cancro gastrico congelati freschi mediante PCR digitale basata su chip. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra la PCR digitale basata su chip, una variante della tecnica PCR digitale utile per rilevare rare varianti di trascrizione. La reazione PCR è suddivisa nelle camere di un chip nanofluidico, ognuna delle quali agisce come una reazione indipendente. La rilevazione di segnali di fluorescenza provenienti dalle camere con bersagli amplificati conferma la presenza di rare varianti di trascrizione nel campione.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

NOTA: Questa procedura è specificamente progettata per la rilevazione di un basso numero di molecole di cDNA in tessuti umani freschi congelati. Le sezioni di tessuto sono state tagliate su ghiaccio secco, mentre erano ancora congelate, da campioni di tumore gastrico derivato da pazienti precedentemente convalidati o da campioni di tessuto normale.

1. Isolamen....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente TRIazol	Thermo Fisher Scientifico	15596018
Glicogeno 20 mg/ml	Roche	10901393001
RNeasy MinElute Kit di pulizia	QIAGEN	Codice: 74204
Kit di sintesi iScript cDNA	BioRad	1708891
QuantStudio 3D PCR digitale Master Mix v2	Thermo Fisher Scientifico	Codice A26358
CDH1a IDT test progettato su misura	Tecnologie integrate del DNA (IDT)	Na	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [concentrazioni di test ottimizzate per dPCR: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)]
Kit chip QuantStudio 3D Digital PCR 20K v2	Thermo Fisher Scientifico	Codice A26316
Affresco della Biofuga di Heraeus	Termo Scientifico	75002402
Termociclatore (Labcycler)	Sensoquest	011-103
Sistema PCR GeneAmp 9700	Thermo Fisher Scientifico	N805-0200
Modulo di campionamento a doppio blocco piatto	Thermo Fisher Scientifico	4425757
Base inclinabile QuantStudio 3D per sistema PCR GeneAmp 9700 a doppio blocco piatto	Thermo Fisher Scientifico	4486414
Kit adattatore per chip PCR digitale 3D QuantStudio per termociclatore a blocco piatto	Thermo Fisher Scientifico	4485513
Caricatore di chip PCR digitale QuantStudio 3D	Thermo Fisher Scientifico	4482592
Strumento PCR digitale 3D QuantStudio con cavo di alimentazione	Thermo Fisher Scientifico	4489084