Saggio Dot Blot per quantificare il genoma virale

NOTA: Le ricette per le soluzioni e i tamponi necessari per questo protocollo sono fornite nella Tabella 1.

1. Macchia di punto

1. Preparazione di standard di DNA plasmidico
   1. Diluire il DNA plasmidico del genoma del vettore AAV a 10 ng/μL in acqua o tampone Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Prelevare 25 μL di questa diluizione e digerire con un enzima di restrizione appropriato per 1 ora per linearizzare il DNA plasmidico in un volume di reazione di 50 μL.
      nota: Facciamo una serie duplicata di digestione (vedi passaggio 1.4.1). L'enzima appropriato dovrebbe essere quello che taglia il DNA plasmidico al di fuori della regione di legame della sonda del dot blot. Per comodità, il DNA plasmidico diluito può essere aliquotato (25 μL/provetta) e conservato congelato a -20 °C per un uso futuro. Digerire il DNA plasmidico mentre le provette tremano nel passaggio 5.1. Non digerire eccessivamente lo standard del DNA plasmidico.
   2. Aggiungere 450 μl di acqua o TE alla provetta contenente lo standard di DNA plasmidico digerito e mescolare accuratamente. Trasferire 70 μl di questa miscela in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL con 1.330 μl di acqua o TE per ottenere uno standard plasmidico diluito (25 pg/μl).
   3. Seguire la Tabella 1 per creare una serie di diluizioni seriali doppie (600 μL/provetta). Mescolare accuratamente le diluizioni agitando per 5 s.
2. Denaturazione di campioni di DNA virale e standard
   1. Aggiungere 600 μl di soluzione alcalina 2x a ciascuna diluizione standard. Mescolare bene agitando per 5-10 s. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
   2. Aggiungere 120 μl di soluzione alcalina 2x a ciascun campione di DNA virale. Mescolare bene agitando per 5-10 s. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
3. Impostazione dell'apparato dot blot
   1. Utilizzando le forbici, tagliare una membrana di tamponamento (ad es. zeta-probe) a una dimensione appropriata per il numero di campioni e gli standard. Immergere la membrana con acqua per 10 minuti prima di posizionarla su un apparecchio a punti. Coprire i pozzetti inutilizzati sull'apparato a membrana.
      nota: Maneggiare la membrana con una pinzetta pulita. Per coprire i pozzetti vuoti, è possibile utilizzare il foglio di protezione azzurro fornito con la membrana. Non lasciare asciugare la membrana prima di legare campioni e standard. Per maggiori dettagli sul montaggio e l'uso dell'apparecchio, fare riferimento al manuale utente.
   2. Aggiungere acqua ai pozzetti in cui verranno caricati i campioni. Applicare il vuoto e tirare l'acqua attraverso i pozzetti per verificare la presenza di errori e ripetere il test quando risolto. Serrare nuovamente le viti mentre si applica il vuoto per garantire una tenuta ermetica.
      nota: Una sigillatura incompleta può causare perdite di campione tra i pozzetti.
   3. Una volta che l'acqua è completamente aspirata, rilasciare completamente il vuoto (ad esempio, il collettore del vuoto deve essere aperto alla pressione dell'aria).
4. Caricamento di standard e campioni nell'apparecchio dot blot
   1. Applicare 400 μl di ogni standard di DNA plasmidico diluito a ciascun pozzetto ed eseguire quattro corsie di diluizioni standard. Utilizzare due aliquote separate del digest standard e caricarle in duplicato. Applicare 200 μL/pozzetto di ciascun campione di DNA virale.
      nota: Utilizzando i restanti ~40 μL di campioni denaturati, i campioni diluiti possono essere preparati (ad esempio, campioni diluiti 10 volte utilizzando 20 μL del campione più 180 μL di 1x soluzione alcalina) e asciugati se necessario.
   2. Applicare un delicato vuoto per estrarre le soluzioni di DNA attraverso il pozzetto.
      nota: La pressione del vuoto deve essere regolata aprendo parzialmente una valvola a tre vie in modo che la pressione del vuoto venga applicata all'apparato dot blot e all'atmosfera (cioè con i bracci del rubinetto posizionati a un angolo di circa 45° dove emette un rumore di aspirazione più forte).
   3. Una volta svuotati tutti i pozzetti, rilasciare il vuoto regolando la valvola a tre vie. Aggiungere 400 μl di soluzione alcalina 1x a ciascun pozzetto che conteneva standard e campioni. Attendere 5 minuti prima di riapplicare il vuoto per svuotare i pozzetti.
   4. Riapplicare il vuoto allo stesso modo.
   5. Smontare l'apparecchio a punti sotto l'aspirapolvere, rimuovere la membrana e risciacquarla con 2x SSC. Posizionare la membrana su un tovagliolo di carta pulito con il lato legato al DNA rivolto verso l'alto per rimuovere l'eccesso di 2x SSC.
   6. Reticolare UV il DNA contaminato alla membrana con un reticolante UV appropriato; la membrana è ora pronta per l'ibridazione><. nota: Le membrane bagnate possono essere utilizzate per la reticolazione UV. Le membrane essiccate e reticolate UV possono essere conservate a temperatura ambiente. Ulteriori informazioni sono disponibili nella Tabella dei Materiali.

2. Ibridazione e lavaggio

1. Riscaldare il tampone di ibridazione in un bagno d'acqua a 65 °C.
2. Marcare enzimaticamente una sonda di DNA con ^α-32P dCTP radioattivo e purificarla utilizzando i kit disponibili in commercio secondo le raccomandazioni del produttore.
   nota: Utilizziamo una sonda di 0,5-2,0 kb di lunghezza da una regione promotore dell'enhancer o da una sequenza codificante una proteina nel genoma virale. Sebbene questo protocollo utilizzi ³²sonde radioattive marcate con P per il rilevamento del segnale, possono essere utilizzate anche sonde chemiluminescenti o fluorescenti non radioattive (fare riferimento alla sezione Discussione).
3. Posizionare la membrana in un flacone di ibridazione con il lato legato al DNA rivolto verso l'alto, sciacquare la membrana con 5 ml di tampone di ibridazione preriscaldato ed eliminare il tampone. Quindi aggiungere 10 mL di tampone di ibridazione preriscaldato e porre il flacone in un forno di ibridazione rotante impostato a 65 °C. Ruotare per ≥5 min.
4. Denaturare a caldo 20 μL di 10 mg/mL di soluzione di DNA di sperma di aringa o salmone tosata e la sonda ^{marcata con 32}P (≥10,⁷ cpm) per 5 minuti posizionando le provette su un blocco termico impostato a 100 °C. Quindi raffreddarli a scatto con ghiaccio per ≥2 minuti, centrifugarli brevemente e tenerli in ghiaccio fino al momento dell'utilizzo.
   cautela: Per le sonde di DNA radioattivo, è necessario utilizzare provette da 1,5 mL con tappi a vite e O-ring.
5. Aggiungere rapidamente il DNA spermatico denaturato e la sonda radioattiva al tampone di ibridazione nel flacone di ibridazione e agitare il flacone per 10 secondi per mescolare. Rimettere il flacone nel forno a 65 °C e incubare il flacone con rotazione a 65 °C per ≥4 h.
6. Una volta completata l'ibridazione, arrestare la rotazione, rimuovere il flacone di ibridazione, quindi versare la soluzione della sonda radioattiva in una provetta conica da 50 ml con tappo a tenuta stagna. Conservare la sonda in un contenitore appropriato posto in un frigorifero destinato ai materiali radioattivi.
   nota: Il tampone di ibridazione usato con una sonda conservata a 4 °C può essere riutilizzato almeno 5 volte posizionando la provetta conica da 50 mL con un tappo a tenuta stagna che contiene il tampone di ibridazione in un bagno d'acqua a 100 °C per 5 minuti.
7. Lavare la membrana con il Wash Buffer riscaldato a 65 °C. Aggiungere da 20 a 30 mL di Wash Buffer al flacone di ibridazione e ruotare per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio altre 2 volte.
   nota: Misurare la radioattività delle soluzioni di lavaggio e registrarla se richiesto dall'istituto locale.
8. Durante il lavaggio della membrana, posizionare uno schermo di imaging al fosforo su una gomma per immagini per 5 minuti.
9. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere la membrana dal flacone di ibridazione, rimuovere il tampone in eccesso sulla membrana con carta assorbente e posizionare la membrana in un supporto di carta di plastica trasparente. Controllare i segnali radioattivi sulla membrana utilizzando un contatore Geiger. Esporre lo schermo di imaging al fosforo cancellato alla membrana per 10 minuti o durante la notte, a seconda dell'intensità del segnale.
10. Scansiona lo schermo utilizzando un sistema di scansione di immagini al fosforo e ottieni i dati sull'intensità del segnale di ciascun punto.

Tabella 1: Standard quantitativi di DNA plasmidico dot blot. Sono mostrati i volumi necessari di 25 pg/μL di soluzione standard di DNA plasmidico e acqua o TE per preparare gli standard di DNA plasmidico mediante diluizioni seriali doppie (600 μL/provetta). I numeri nella colonna standard del DNA plasmidico (da 0,039 a 5 ng) sono la quantità di DNA in 200 μL di ciascuna soluzione standard di DNA plasmidico.