1. Preparazione del campione
- Assumere 50 mg di tessuto di topo in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 200 μL di tampone di lisi (50 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1% Triton X-100, 10% glicerolo), integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi (100 mM NaF, 0,1 mM fenilmetilsulfonilfluoruro, 5 μg/mL di pepstatina, 10 μg/mL di leupeptina, 5 μg/mL di aprotinina).
- Omogeneizzare il fazzoletto con un omogeneizzatore per 1 minuto su ghiaccio.
- Centrifugare per 10 minuti a 8.000 x g a 4 °C.
- Raccogliere il surnatante in nuove provette (1,5 mL) ed estrarre 1 μL per il test della concentrazione proteica con un kit BCA.
NOTA: Tutti i tamponi di lisi comunemente usati per l'analisi western blot e l'analisi Dot blot possono essere utilizzati per l'analisi QDB.
2. Determinazione della specificità dell'anticorpo
- Preparare i lisati del campione (20 μg) nella sezione 1.4, BSA privo di IgG (20 μg) e proteina standard (600 pg), per l'analisi del western blot.
NOTA: La BSA priva di IgG viene utilizzata come controllo negativo e la proteina standard viene utilizzata come controllo positivo. La specificità dell'anticorpo è dimostrata mostrando una banda della giusta dimensione utilizzando l'analisi western blot.
3. Definire l'intervallo lineare dell'analisi QDB
- Sciogliere la proteina standard con ddH2O. Diluire la proteina a una concentrazione di 1.200 pg/μL.
- Diluire le proteine concentrate dai campioni preparati nella sezione da 1,4 a 4 μg/μL.
- Sciogliere la BSA con ddH2O. Diluire la proteina a una concentrazione di 1.200 pg/μL e 4 μg/μL.
- Una serie di diluizioni di proteine standard e campioni preparati sono stati preparati con la guida della Tabella 1 e della Tabella 2.
- Miscelare 10 μL di proteine standard di diluizione o campioni preparati per la diluizione e 10 μL di tampone di caricamento 2x (120 mM Tris-HCl pH 6,8, 20% glicerolo, 4% SDS, 0,2% blu di bromfenolo, 200 mM DTT).
- Scaldare i composti a 85 °C per 5 min.
4. Processo di analisi QDB
- Esempio di applicazione
- Sostenere la piastra QDB per evitare che la parte inferiore della piastra tocchi la superficie del tavolo. Ad esempio, utilizzare una scatola di puntali per pipette vuota come supporto.
- Caricare fino a 2 μl di campione al centro della membrana nella parte inferiore della singola unità della piastra QDB.
- Asciugatura del piatto
- Lasciare la piastra QDB caricata per 1 ora a temperatura ambiente (RT) o, in alternativa, lasciare la piastra caricata a 37 °C per 15 minuti in un ambiente ben ventilato.
- Blocco della piastra
- Immergere la piastra QDB nel tampone di trasferimento (0,039 M Glycine, 0,048 M Tris, 0,37% SDS, 20% alcol metilico) e agitare delicatamente la piastra per 10 s.
- Sciacquare delicatamente la piastra QDB con TBST (soluzione salina tamponata Tris, 0,1% Tween 20) tre volte, quindi lavare la piastra per 5 minuti in TBST agitando costantemente.
- Bloccare la piastra QDB con il tampone bloccante (5% di latte scremato in TBST (100 μL/pozzetto) per 1 ora agitando costantemente.
- Incubazione degli anticorpi primari
- Diluire l'anticorpo primario nel tampone bloccante a una concentrazione prescelta (da 1:500 a 1:5.000) e aggiungere 100 μl a ogni singolo pozzetto di una normale piastra a 96 pozzetti. Inserire la piastra QDB nella piastra a 96 pozzetti e incubare le piastre combinate per 2 ore a RT o per una notte a 4 °C sotto agitazione costante.
- In alternativa, posizionare la piastra QDB all'interno di una scatola e riempire la scatola con un tampone bloccante da 2 a 3 mm sopra la parte della membrana della piastra se lo stesso anticorpo viene utilizzato per l'intera piastra. Aggiungere l'anticorpo primario alla concentrazione prescelta e incubare la piastra per 2 ore a RT o per una notte a 4 °C sotto agitazione costante.
- Sciacquare delicatamente la piastra con TBST tre volte prima di lavarla con TBST tre volte, ogni volta per 5 minuti agitando costantemente.
- Incubazione di anticorpi secondari
- Diluire l'anticorpo secondario nel tampone bloccante alla concentrazione prescelta (da 1:1.000 a 1:50.000) e aliquotare 100 μL/pozzetto in una piastra a 96 pozzetti o in una scatola come descritto nella sezione 4.4.2, quindi incubare la piastra QDB all'interno della piastra a 96 pozzetti caricata o della scatola per 1 ora a RT sotto agitazione costante.
- Sciacquare delicatamente la piastra QDB 3 volte con TBST, quindi lavare la piastra 3 volte, 5 minuti ciascuna con TBST agitando costantemente.
- quantificazione
- Preparare il substrato di chemiluminescenza potenziato (ECL) seguendo le istruzioni del produttore.
- Aliquotare il substrato ECL in una piastra a 96 pozzetti (100 μL/pozzetto) e inserire la piastra QDB all'interno della piastra a 96 pozzetti per 2 minuti agitando costantemente.
- Rimuovere la piastra QDB dalla piastra a 96 pozzetti e agitare brevemente per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare la piastra su una piastra per microtitolazione bianca.
- Accendere il lettore di micropiastre e selezionare "piastra con coperchio" sull'interfaccia utente prima di posizionare le piastre combinate (piastra QDB + adattatore per piastra bianca) all'interno del lettore di micropiastre per la quantificazione.
NOTA: Assicurarsi di utilizzare la piastra per microtitolazione bianca e non trasparente come adattatore per evitare qualsiasi interferenza dalla piastra. Assicurarsi di scegliere "piastra con coperchio" per evitare di inceppare la macchina quando le piastre combinate (piastra QDB + adattatore per piastra a 96 pozzetti) vengono posizionate all'interno del lettore di micropiastre.
Tabella 1. Schema di diluizione per la curva proteica standard.
| S1
(0pg/μl) | S2 (33,3 pg/μl) | S3
(100 pg/μl) | S3
(300 pg/μl) | S5
(600 pg/μl) | S6
(1200 pg/μl) |
| Proteina standard (1200 pg/μl) | 0 | 1.39 | 4.17 | 12.5 | 25 | 50 |
BSA
senza IgG
(4pg/μl) | 50 | 48,61 | 45,83 | 37,5 | 25 | 0 |
| totale | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabella 2. Schema di diluizione per campioni preparati
| X1
(0μg/μl) | X2
(0,25 μg/μl) | X3
(0,5 μg/μl) | X4
(1μg/μl) | X5
(2μg/μl) | X6
(4 μg/μl) |
| Campione (4μg/μl) | 0 | 3,125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 |
| BSA senza IgG (4μg/μl) | 50 | 46.875 | 43,75 | 37,5 | 25 | 0 |
| totale | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
