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NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando kit e reagenti standardizzati e disponibili in commercio al fine di aumentare la riproducibilità (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione dei campioni
- Estrazione delle proteine
- Trasferire campioni di cellule o tessuti congelati a scatto da -80 °C su ghiaccio secco, scongelare su ghiaccio e lavare secondo necessità con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata. Evita inutili cicli di congelamento-scongelamento in quanto ciò influirà sulla qualità delle proteine.
- Aggiungere a ciascun campione il tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% desossicolato di sodio, 0,1% SDS) contenente 1x inibitore della proteasi, utilizzando la quantità ottimale per peso tissutale.
nota: A seconda dell'applicazione, il tipo e la quantità di tampone di omogeneizzazione potrebbero richiedere un'ulteriore ottimizzazione.
- Utilizzare un omogeneizzatore elettrico portatile con un pestello in polipropilene per omogeneizzare i campioni di tessuto. Tra un campione e l'altro, lavare il pestello in acqua distillata e asciugarlo con un fazzoletto pulito. Cambia il pestello tra diverse condizioni sperimentali e tessuti.
- Lasciare i campioni in ghiaccio per 10 minuti dopo l'omogeneizzazione. Centrifugare i campioni a >10.000 x g a 4 °C per 10 minuti.
- Trasferire il surnatante in un nuovo tubo di ghiaccio senza disturbare il pellet. Il surnatante è il campione proteico. Conservare la proteina estratta a -80 °C o procedere direttamente alla misurazione della concentrazione proteica.
- Quantificazione e normalizzazione della concentrazione proteica
- Misurare la concentrazione proteica utilizzando un test dell'acido bicinconninico (BCA). Preparare una miscela di dosaggio BCA secondo le istruzioni del produttore in una piastra ottica a 96 pozzetti utilizzando 200 μl di miscela di BCA per pozzetto.
nota: Altri metodi di quantificazione, come i saggi di Lowry e Bradford, possono essere utilizzati per determinare la concentrazione proteica, a condizione che la concentrazione proteica sia quantificata in modo coerente in tutti gli esperimenti.
- Preparare gli standard di albumina sierica bovina (BSA) a concentrazioni crescenti in triplicato e aggiungere 1 μL di ciascun campione proteico in duplicato. Incubare la piastra a 96 pozzetti in un blocco termico preriscaldato a 60 °C per 10 minuti o più se si prevede che la concentrazione proteica sia bassa.
- Dopo l'incubazione, misurare l'assorbimento a 560 nm utilizzando un lettore di piastre.
- Esporta le misure del lettore di piastre e calcola la concentrazione proteica confrontando i valori medi di assorbanza di ciascun campione con una curva standard ottenuta utilizzando lo standard proteico. Il valore R al quadrato per la curva standard deve essere maggiore o uguale a 0,98 per stimare con precisione la concentrazione di proteine del campione.
- Normalizzare la quantità di proteine preparando diluizioni di campioni proteici in tampone campione e acqua ultrapura. Il volume totale può essere regolato a seconda del tipo di gel utilizzato. Si consiglia di caricare 30 μg di proteine per corsia come quantità iniziale. Aggiungere un agente riducente come il ditiotreitolo (DTT; concentrazione finale 5 mM) o il beta-mercaptoetanolo (concentrazione finale 200 mM) a ciascun campione, se necessario. Pipettare il beta-mercaptoetanolo non diluito in una cappa aspirante.
- Incubare i campioni in un blocco termico a 70 °C per 10 minuti. Mettere i campioni su ghiaccio, vorticare e centrifugare brevemente per raccoglierli. Tenere in ghiaccio fino al caricamento del gel.
2. Elettroforesi su gel di campioni di proteine
- Configurazione del dispositivo e del gel
- Impostare un gel a gradiente di Bis-Tris prefabbricato al 4-12% (vedere la Tabella dei materiali) nel sistema della camera di elettroforesi su gel. Sciacquare i gel con acqua distillata prima dell'uso.
NOTA: A seconda delle dimensioni, delle interazioni e dell'abbondanza della proteina di interesse, possono essere utilizzati gel con un diverso gradiente, agente tampone o dimensione e numero di pozzetti.
- Aggiungere 500 ml di 1x tampone di funzionamento MES SDS diluito in acqua a doppia distillazione per serbatoio. Rimuovere con cautela il pettine dai gel dopo aver aggiunto il tampone di corsa senza disturbare i pozzetti nel gel di impilamento.
- Carico proteico
- Caricare 3,5 μL di uno standard proteico nel pozzetto. A seconda del layout del campione, il caricamento di una scala proteica su entrambi i lati del gel può aiutare a stimare in modo più accurato le dimensioni delle proteine. Utilizzare punte di caricamento in gel con punta fine per un caricamento più accurato del campione.
- Quando si utilizza uno standard interno per la normalizzazione tra le membrane (vedere il passaggio 5 di seguito e la discussione), caricare una quantità uguale agli altri campioni nei primi 3 pozzetti accanto alla scala delle proteine.
- Caricare 30 μg di ciascun campione nei pozzetti rimanenti. Aggiungere 1x tampone campione a tutti i pozzetti vuoti.
- elettroforesi
- Assemblare il serbatoio del gel dopo aver caricato i campioni. Far passare i campioni attraverso il gel di impilamento a 80 V per 10 minuti, seguiti da 150 V per altri 45-60 minuti.
3. Trasferimento di proteine
NOTA: Il trasferimento delle proteine in questo protocollo viene eseguito utilizzando un sistema di blotting semi-secco disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) per risultati rapidi e coerenti.
- Preparare il trasferimento delle proteine immergendo la carta da filtro in acqua distillata doppia e assicurandosi che il coltello da gel, la pipetta Pasteur in plastica, il rullo assorbente e la pinza siano pronti per l'uso.
- Aprire la pila di trasferimento rimuovendo con cautela tutta la pellicola di avvolgimento. Togliete la parte superiore dalla pila inferiore e mettetela da parte. Inumidire rapidamente la membrana sul pacco inferiore con diverse gocce di tampone di corsa per elettroforesi (2-3 mL). Una volta aperta la pila di trasferimento, è importante evitare che la membrana in PVDF si secchi.
- Dopo aver interrotto l'elettroforesi, aprire il gel prefabbricato utilizzando il coltello per gel e tagliare il gel di impilamento. Taglia il gel attorno ai bordi per liberarlo dal calco di plastica. Tenere il coltello in gel bagnato per evitare danni al gel.
- Assemblare la pila di trasferimento dal basso verso l'alto: pila inferiore (contenente la membrana PVDF), gel proteico e carta da filtro. Utilizzare il rullo assorbente per rimuovere tutte le bolle d'aria. Posiziona la risma superiore sopra la carta da filtro e arrotola nuovamente la pila per rimuovere le bolle d'aria. Non spingere troppo forte in quanto ciò potrebbe causare la deformazione del gel durante il trasferimento delle proteine.
- Trasferire l'intera pila nel dispositivo di trasferimento con l'elettrodo sul lato sinistro del dispositivo e posizionare la spugna in gel sopra la pila in modo che sia allineata con i corrispondenti contatti elettrici sul dispositivo. Chiudere il coperchio, selezionare e avviare il programma appropriato (20 V per 7 minuti è un punto di partenza consigliato).
- Al termine, lasciare il coperchio chiuso per 2 minuti per consentire alla pila di raffreddarsi ed evitare che la membrana si secchi. Rimuovere la pila di trasferimento e tagliare la membrana fino alla dimensione del gel. Lavare rapidamente la membrana tagliata con acqua distillata prima di continuare con la colorazione proteica totale.
4. Colorazione totale delle proteine
NOTA: L'utilizzo del rilevamento fluorescente offre un vantaggio sostanziale rispetto agli approcci più tradizionali (ad esempio, il rilevamento ECL), poiché la gamma lineare e la sensibilità possono essere controllate molto meglio. Pertanto, nelle fasi 4 e 5, vengono utilizzati TPS fluorescenti e anticorpi secondari fluorescenti (vedere Tabella dei materiali).
- Arrotolare la membrana in una provetta da 50 ml con il lato proteico rivolto verso l'interno. A causa della sensibilità alla luce del TPS fluorescente e degli anticorpi secondari, tutte le fasi successive vengono eseguite al buio.
- Aggiungere 5 mL di soluzione di colorante proteico (vedere la Tabella dei materiali) e incubare su un rullo per 5 minuti a temperatura ambiente. Poiché il TPS e il tampone di lavaggio contengono metanolo, eseguire questi passaggi in una cappa aspirante.
- Eliminare la soluzione colorante e lavare due volte rapidamente con 5 mL di soluzione di lavaggio (6,3% di acido acetico in 30% di metanolo). Riposizionare brevemente il tubo sul rullo tra le fasi di lavaggio. Sciacquare brevemente la membrana con acqua ultrapura prima di continuare.
5. Blocco, incubazione degli anticorpi e rilevamento
- Blocco della membrana: aggiungere 3 mL di tampone bloccante (vedere la Tabella dei materiali) alla provetta da 50 mL contenente la membrana. Incubare la membrana su un rullo per 30 minuti a temperatura ambiente. A seconda della scelta dell'anticorpo, il tipo di tampone bloccante utilizzato può richiedere un'ottimizzazione.
- Incubazione degli anticorpi primari
- Eliminare il tampone bloccante e sostituirlo con l'anticorpo primario alla concentrazione appropriata e ottimizzata (Figura 1 e Figura 2: anti-SMN per topo, a 1:1.000, diluito in tampone bloccante).
nota: Un'adeguata ottimizzazione degli anticorpi primari dovrebbe includere la conferma che l'anticorpo rileva un prodotto proteico della giusta dimensione, pur mostrando un legame minimo o nullo con altri prodotti proteici non specifici. Se possibile, testare e confrontare più anticorpi contro la proteina di interesse.
- Incubare la membrana su un rullo per una notte a 4 °C. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di anticorpi e lavarla 6 volte per 5 minuti con 1x PBS su un rullo a temperatura ambiente (RT).
- Incubazione secondaria degli anticorpi
- Preparare l'anticorpo secondario specifico a 1:5.000 contro l'ospite dell'anticorpo primario in un tampone bloccante da 5 mL. Altri anticorpi secondari possono richiedere altre diluizioni o l'uso di tamponi bloccanti alternativi.
- Incubare la membrana con la soluzione di anticorpi secondari su un rullo per 1 ora a RT. Dopo l'incubazione, lavare la membrana tre volte per 30 minuti con 1x PBS su un rullo.
- Asciugare la membrana e tenerla protetta dalla luce con un foglio di alluminio fino al rilevamento. Le membrane possono essere conservate a 4 °C per una conservazione a lungo termine.
- Acquisizione delle immagini
- Accedere al computer collegato allo scanner. Posizionare la membrana sullo scanner con il lato proteico rivolto verso il basso e selezionare l'area di scansione nel software.
- Ottimizza l'intensità del laser per entrambi i canali (700 nm e 800 nm), confermando che non si verifica alcuna saturazione. Acquisire le immagini in entrambi i canali ed esportare le immagini per ulteriori analisi (passaggio 6).
6. Analisi e quantificazione del Western blot
NOTA: Queste raccomandazioni si basano sul software Image Studio disponibile gratuitamente. Tuttavia, analisi comparabili possono essere eseguite anche utilizzando altri pacchetti software, come ImageJ.
- Importare il file: creare un'area di lavoro locale nel computer utilizzato per l'analisi. In questo modo viene generato un database di file di immagine per i western blots acquisiti. Importa i file ottenuti sullo scanner e seleziona l'immagine per l'analisi.
- Analisi TPS
- Visualizza il canale a 700 nm per mostrare il risultato totale della colorazione delle proteine. Un esempio di immagine TPS è incluso nella Figura 1 in cui vengono confrontati direttamente diversi tessuti di topi neonatali (P5) (Figura 1A-B) e di 10 settimane (Figura 1C-D). Allo stesso modo, la Figura 2 mostra un esempio di confronto diretto del tessuto cerebrale di topi di età diverse.
- Selezionare la scheda Analisi nell'angolo in alto a destra e selezionare Aggiungi rettangolo per definire l'area di interesse per la normalizzazione (Figura 1B, D). Copia e incolla la prima area del rettangolo su ogni singolo campione per assicurarti che la regione definita abbia le stesse dimensioni per tutte le corsie analizzate.
- Copia il risultato dalla scheda Forme nell'angolo in basso a sinistra del software.
- Quantificazione
nota: L'approccio ottimale per quantificare i campioni dipende dal disegno sperimentale. Forniremo qui un esempio illustrativo della rilevazione della proteina del motoneurone di sopravvivenza (Smn; una proteina chiave coinvolta nella malattia neuromuscolare atrofia muscolare spinale), che è nota per diminuire nel tempo, e di come la normalizzazione dell'intensità del segnale Smn al TPS fornisca stime affidabili dello sviluppo dell'espressione proteica.
- La Figura 2 mostra una diminuzione dell'espressione di Smn con l'aumentare dell'età dell'animale con TPS come controllo del carico proteico. Ripetere i passaggi 6.2.1-6.2.3 per quantificare il carico proteico (Figura 2B). Ripetere i passaggi 6.2.1-6.2.3 nel canale a 800 nm (Figura 2A) per analizzare la proteina di interesse.
- Copia i risultati sia dal TPS che dalla proteina di interesse in un programma per fogli di calcolo. Sul foglio di calcolo, per prima cosa, normalizzare il carico proteico determinando il segnale TPS più alto e dividendo ogni valore del segnale TPS per questo valore per ottenere il valore di carico proteico normalizzato.
- Dividere il valore del segnale di 800 nm da ogni singolo campione per il corrispondente valore proteico normalizzato per calcolare il rapporto di espressione proteica relativa in campioni diversi.
- Dopo la prima normalizzazione, confrontare vari punti temporali o tessuti con il valore medio dello standard interno per consentire confronti diretti tra diverse membrane ed esperimenti.
